張 茜，馮振卿，2

1南京醫(yī)科大學國家衛(wèi)健委抗體技術(shù)重點實驗室，2病理學系，江蘇 南京 211166

新型冠狀病毒肺炎是由2019 新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019?nCoV）引起的肺炎，其病原體從未在人類中發(fā)現(xiàn)，且具有人傳染人的特點，嚴重危害人類健康［1］。由該新型冠狀病毒引起的肺炎疫情是繼嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS）之后，給全球公共衛(wèi)生安全帶來的一個新的巨大挑戰(zhàn)。目前我國新型冠狀病毒肺炎疫情防控已處于I 級應急響應，疫情不容樂觀。到目前為止，還沒有針對新型冠狀病毒的化學合成藥物、抗體藥物及疫苗上市，一些廣譜抗病毒藥物已用于新型冠狀病毒肺炎的臨床治療，但療效并不確切。因此，根據(jù)新型冠狀病毒的結(jié)構(gòu)特點、抗原表位等，尋找治療該病毒的靶向、高效、低毒的抗體藥物和疫苗，是目前國內(nèi)外醫(yī)學領(lǐng)域的當務之急。本文根據(jù)當前針對新型冠狀病毒的抗體檢測、中和抗體及疫苗研發(fā)策略等進行綜述，以期為突發(fā)重大疫情防控抗體藥物和疫苗的研發(fā)提供可供借鑒的思路。

1 對新型冠狀病毒的認識

2019年12月，我國湖北省武漢市暴發(fā)不明原因的肺炎疫情，以發(fā)熱、乏力、干咳、嚴重者并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征為主要臨床特征，對人類健康和世界公共衛(wèi)生安全構(gòu)成重大威脅［2］。由該新型冠狀病毒引起的肺炎，迅速傳播至全國31個省、自治區(qū)、直轄市和港澳臺地區(qū)，并向亞洲、澳洲、歐洲、美洲傳播。截止2020 年2 月18 日24 時，全國臨床確診新型冠狀病毒肺炎病例74185例，死亡2009例。相較于2002—2003 年的SARS 感染率明顯升高，但死亡率有所下降［3?4］。

2020 年1 月，中國科研人員通過對肺炎患者樣本進行基因測序分析，發(fā)現(xiàn)其為一種從未出現(xiàn)過的β冠狀病毒屬病毒，將其命名為2019?nCoV，該病毒被認為與SARS 病毒（SARS coronavirus，SARS?CoV）和中東呼吸綜合征病毒（middle east respiratory syn?drome coronavirus，MERS?CoV）不同，是一種可以感染人的冠狀病毒科新成員［5］。近日，國際病毒分類委員會正式將2019?nCoV命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coro?navirus 2，SARS?CoV?2），WHO 將SARS?CoV?2 引起的新型冠狀病毒肺炎命名為2019?冠狀病毒?。╟o?rona virus disease 2019，COVID?19）［6］。這一命名表明從分類學上，新型冠狀病毒與SARS 病毒具有同科同屬不同種的親緣關(guān)系。

根據(jù)冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)生學分析，冠狀病毒科分為α、β、γ和δ 4 個屬，α、β屬的冠狀病毒可感染哺乳動物和人。SARS?CoV?2 屬于β屬的新型冠狀病毒，圓形或橢圓形，直徑60～140 nm，電鏡下呈皇冠樣形狀［7］。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，SARS?CoV?2 與SARS?CoV 的7 個保守非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸相似度為94.6%［8］。經(jīng)病毒序列比對分析，SARS?CoV?2 與蝙蝠SARS 樣冠狀病毒（bat?SL?CoVZC45）同源性達85%以上，推測SARS?CoV?2 自然宿主可能是蝙蝠，但該冠狀病毒感染的肺炎是由蝙蝠直接傳播還是通過中間宿主傳播，尚未被證實［9］。最近華南農(nóng)業(yè)大學提出穿山甲很可能是新型冠狀病毒的潛在中間宿主，其研究結(jié)果有待進一步驗證。目前多個實驗室已成功在Vero?E6細胞中分離獲得該病毒。

2 針對新型冠狀病毒的抗體診斷技術(shù)

機體在受到病毒感染時，免疫細胞會分泌產(chǎn)生一類特異性免疫球蛋白，保護機體免受病毒感染，檢測針對病毒產(chǎn)生的這類特異性抗體可用于監(jiān)測機體的免疫狀態(tài)。SARS?CoV?2核酸檢測，主要采用實時熒光定量PCR 檢測SARS?CoV?2 核酸基因，由于不同部位病毒載量不同，取樣部位不佳，實驗室檢測操作規(guī)程不一致，實際靈敏度差異，樣本可能污染以及病毒RNA 易降解等原因，其陽性率僅為30%～50%，假陰性率較高。因此，針對SARS?CoV?2的快速診斷和現(xiàn)場檢測的產(chǎn)品開發(fā)尤為重要，其中采用膠體金技術(shù)和酶聯(lián)免疫技術(shù)建立的抗體檢測試劑及SARS?CoV?2抗原檢測試劑已經(jīng)研發(fā)并用于臨床。

不同于病毒核酸檢測技術(shù)，SARS?CoV?2抗體檢測技術(shù)是通過檢測感染者血液中SARS?CoV?2特異性IgM/IgG 抗體，在30 min 內(nèi)完成對SARS?CoV?2 感染的快速診斷［10］。目前SARS?CoV?2抗體檢測試劑盒已在深圳完成了新型冠狀病毒肺炎患者血液樣本的檢測，結(jié)果顯示IgM臨床符合率＞90%，IgG臨床符合率＞95%，明顯高于核酸檢測結(jié)果。相比于核酸檢測使用樣本多為上呼吸道樣本（咽拭子為主），采集過程中醫(yī)護人員感染風險較大，而SARS?CoV?2的IgM 和IgG 抗體檢測試劑盒采用血清或血漿作為檢測樣本，為疑似患者排查和無癥狀感染者篩查提供了不依賴于設(shè)備、更快速的現(xiàn)場檢測手段。由于血液樣本采集便捷，且血液樣本含病毒量低或不含病毒，大大降低了醫(yī)護人員被感染的風險。另外抗體檢測時間短，操作簡單，檢測靈敏度高，在保護醫(yī)護人員安全的同時也極大提高了臨床檢測的效率。

3 關(guān)于新型冠狀病毒中和抗體的研制

對于突發(fā)重大傳染性疾病的防治，中和抗體治療是有效預防和治療的一個重要策略。抗體分子能夠通過阻斷病毒顆粒與其受體結(jié)合，激活巨噬細胞、NK 細胞等免疫細胞和補體等多種機制來殺傷、清除病毒顆粒以及受感染細胞［11］。抗體制劑不但可用于流行區(qū)的高危易感人群的緊急被動免疫，而且對于臨床患者也具有較好的治療作用。據(jù)2月13日最新報道，應用康復期新型冠狀病毒肺炎患者血漿制備的特免血漿制品可有效治療新型冠狀病毒肺炎，患者在接受血漿治療12～24 h后，患者炎癥相關(guān)指標明顯下降，淋巴細胞比例上升，血氧飽和度、病毒載量等重點指標全面提升，患者體征和癥狀明顯好轉(zhuǎn)。從臨床免疫機制來看，大部分新型冠狀病毒肺炎患者康復后，機體內(nèi)會產(chǎn)生針對SARS?CoV?2的特異性抗體，能有效清除病毒。在目前缺乏疫苗和特效治療藥物的特殊情況下，采用特免血漿制品治療SARS?CoV?2 感染是最為有效的方法之一，能明顯降低危重患者的病死率。但特免血漿制品面臨來源受限、供受體血型不匹配和潛在的傳染風險等限制［12-13］，因此研發(fā)可用于臨床治療的抗SARS?CoV?2中和抗體對于新型冠狀病毒肺炎的治療和疫情控制具有重要的臨床應用價值。

目前治療性抗體主要有鼠源抗體、人源化抗體、全人抗體和小分子抗體等4 種形式。鼠源單克隆抗體具有較強的免疫原性，人體易產(chǎn)生人抗鼠抗體（human anti?mouse antibodies，HAMA）反應及超敏反應，且分子量大，難以穿膜、半衰期短等，其在疾病治療領(lǐng)域應用受到限制。隨著分子遺傳學、分子免疫學技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)及噬菌體抗體表面展示技術(shù)的進展，應用基因工程方法建立的噬菌體抗體庫技術(shù)開始出現(xiàn)［14］。目前制備人源化或全人抗體的方法包括：通過基因工程技術(shù)對鼠源抗體進行人源化改造；構(gòu)建噬菌體抗體庫，制備全人抗體；免疫轉(zhuǎn)人抗體基因小鼠制備人源雜交瘤抗體等［15］。其中噬菌體抗體庫技術(shù)較為成熟，并于2018年獲諾貝爾化學獎。全人抗體可消除鼠源單抗的免疫原性，避免HAMA 反應和超敏反應［16］，在臨床疾病治療中得到廣泛應用。

中和抗體具有識別病毒表面蛋白、阻斷其與細胞表面特異性受體結(jié)合的功能，從而發(fā)揮抗病毒作用。SARS?CoV?2 是具有包膜的正鏈RNA 病毒，其表面棘突S蛋白（spike protein）是冠狀病毒表面重要的受體結(jié)合位點，具有與細胞表面病毒特異性受體結(jié)合、介導病毒外膜與細胞融合、病毒吸附及穿膜等作用。研究表明，冠狀病毒S 蛋白受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）在病毒與宿主細胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin?converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合、進入宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用［17］。據(jù)研究報道，SARS?CoV?2 與SARS?CoV相似，都是通過與ACE2 結(jié)合進入人體細胞，二者S蛋白S1亞基RBD有高度相似性［18］。因此，制備針對新型冠狀病毒S 蛋白的抗體，可與病毒表面S 蛋白RBD結(jié)合，阻斷S蛋白RBD與ACE2結(jié)合，從而阻斷病毒入侵，這是中和抗體發(fā)揮抗病毒效應的重要保護方式。研究發(fā)現(xiàn)，SARS?CoV 特異性單克隆抗體CR3022 可與SARS?CoV?2RBD 有效結(jié)合［19］。此外，可通過采集新型冠狀病毒肺炎康復者的外周血分離外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），構(gòu)建免疫型噬菌體抗體庫，篩選針對SARS?CoV?2的S蛋白或RBD的特異性中和抗體，研發(fā)用于治療新型冠狀病毒肺炎的抗體藥物。

但需要注意的是，在SARS?CoV抗S蛋白中和抗體研究過程中，發(fā)現(xiàn)機體產(chǎn)生的中和或非中和抗體可能是誘發(fā)急性肺部炎癥因子風暴的原因之一，實驗數(shù)據(jù)顯示，SARS死亡患者體內(nèi)的抗S蛋白抗體滴度顯著高于恢復期患者，提示冠狀病毒對機體造成的巨噬細胞炎癥反應很可能加劇了肺部炎癥［20］。因此，在針對SARS?CoV?2 中和抗體研發(fā)與臨床應用過程中，病毒感染引起的急性炎癥因子風暴亦需足夠重視。

4 新型冠狀病毒中和表位對亞單位疫苗研發(fā)的應用價值

疫苗是預防傳染性疾病的有效方法之一。疫苗種類包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗。由于當前SARS?CoV?2 生物安全要求級別高，前兩類傳統(tǒng)疫苗毒力返強或滅活不完全的安全性問題不容忽視。因此，利用基因重組技術(shù)的亞單位疫苗是當前新型冠狀病毒疫苗研發(fā)的重要方向。

SARS?CoV?2 的S 蛋白含有病毒抗原的中和表位，其氨基酸序列改變將對病毒的毒力強弱產(chǎn)生影響，也可使人群原有的特異性免疫力喪失。若找到針對多個不同亞型病毒株的抗原保守中和表位，將對后期可能發(fā)生流行及變異的新型冠狀病毒的預防和臨床治療具有重要意義。SARS?CoV?2 跨物種傳播人在很大程度上是由于其具有與SARS?CoV類似的受體結(jié)合表位。研究表明，SARS?CoV?2 與SARS?CoV 的S蛋白比較，雖然5個關(guān)鍵氨基酸位點有4個發(fā)生突變，但SARS?CoV?2仍能保持其核心結(jié)構(gòu)與ACE2分子相互作用，二者RBD結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)幾乎相同［18］。Wrapp 等［21］分析發(fā)現(xiàn)，SARS?CoV?2 S 蛋白與ACE2 的親和力是SARS?CoV 的10～20 倍，COVID?19基本傳染數(shù)（R0）高達3.77，這表明SARS?CoV?2是通過S蛋白與人ACE2相互作用而感染人呼吸道上皮細胞，且其傳染性強于SARS?CoV。Zhou等［22］研究發(fā)現(xiàn)，SARS?CoV?2可結(jié)合人、蝙蝠、果子貍和豬來源的ACE2受體，并且無法感染不含ACE2的細胞；同時還證實SARS?CoV?2 不能結(jié)合冠狀病毒其他常見受體（如APN和DPP4）。因此，對SARS?CoV?2 S 蛋白的抗原表位和RBD 進行鑒定和研究，可為SARS?CoV?2 亞單位疫苗的研發(fā)及抗病毒免疫策略設(shè)計提供理論依據(jù)。

鑒定病毒中和表位能促進亞單位疫苗的研制，有助于闡明抗體與病毒的作用機制。通過構(gòu)建全人源SARS?CoV?2 免疫型噬菌體抗體庫，篩選具有中和活性的抗SARS?CoV?2抗體，利用噬菌體隨機肽庫，結(jié)合蛋白3D模型軟件與點突變檢測技術(shù)，可預測鑒定針對新型冠狀病毒S蛋白的中和表位［23-24］。

目前科研工作者已經(jīng)對SARS?CoV?2 基因組序列、蛋白晶體結(jié)構(gòu)等進行了研究，這對疫苗的研發(fā)提供了很大幫助。自中國疾控中心首發(fā)第1 株SARS?CoV?2毒株信息后，浙江、廣州、上海等地相繼報道成功分離出SARS?CoV?2毒株以及相關(guān)病毒位點突變信息，這為SARS?CoV?2的變異監(jiān)測、藥物篩選、致病機制研究以及疫苗研發(fā)等提供了重要依據(jù)。

5 展 望

SARS?CoV?2抗體檢測試劑的應用，顯著提高了當前新型冠狀病毒肺炎的篩查效率，有效降低了醫(yī)護人員感染的風險?；赟ARS?CoV?2 S 蛋白的中和抗體和亞單位疫苗的研發(fā)受到國內(nèi)外矚目，其可能產(chǎn)生的急性炎癥因子風暴也應引起關(guān)注，所以中和抗體和疫苗的研發(fā)需兼顧有效性和安全性。相信通過全球科研人員的協(xié)同合作，SARS?CoV?2抗體藥物和疫苗的研發(fā)將會取得突破性進展，將對新型冠狀病毒肺炎疫情的防控起到?jīng)Q定性作用。