劉 威，劉 博，蔡衛(wèi)佳，王 昊，陳 芬，譚 軍

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷 223800）

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬落葉灌木或喬木[1]，營養(yǎng)價值高、花期長、色彩鮮艷，是食用、觀賞和藥用皆可的果樹[2]。軟籽石榴，籽粒柔軟且粒大多汁、品質(zhì)好，相比普通石榴，食之無渣，可食率較高，為石榴果中珍品，市場潛力較大[3]。

文章對軟籽石榴引種、栽培品種、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、栽培技術(shù)等方面的研究成果進(jìn)行了闡述，并對存在的問題及未來的研究重點(diǎn)及方向進(jìn)行了解析和推斷，旨在為從事軟籽石榴研究的科技人員提供幫助。

1 引種

我國傳統(tǒng)石榴籽粒較硬，可食性差，軟籽石榴的引進(jìn)改變了這一缺點(diǎn)。突尼斯軟籽石榴為國內(nèi)第1個引種成功的軟籽石榴品種。國家林業(yè)考察團(tuán)于1986年由突尼斯引進(jìn)，經(jīng)栽培選育后于2002年將該品種命名為突尼斯軟籽石榴[4]。2013年姚芳研究團(tuán)隊(duì)[5]從以色列引進(jìn)軟籽石榴新品種并栽培成功，分別為P.G.118-19、Jel-Lore、Bedana、Jabal 1和Jabal 2。國內(nèi)地區(qū)之間的引種頗多，優(yōu)良軟籽石榴品種的引種成功，既豐富了果品樹種，又為當(dāng)?shù)鼐用駧砹司薮蟮慕?jīng)濟(jì)效益。

眾多軟籽石榴品種中，突尼斯軟籽石榴被廣泛栽培，引種地區(qū)較廣，栽培表現(xiàn)良好[6]。突尼斯軟籽石榴引種我國以后，首先種植于河南省河陰石榴基地，表現(xiàn)出優(yōu)良的品種特性[4]。隨后河南[7-9]、江蘇[10-11]、湖南[12]、安徽[13]、浙江[14]、四川[15]、陜西[16]、云南[17]等省均有引進(jìn)種植，經(jīng)過多年引種觀察和研究，形成了一系列豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)栽培技術(shù)，其他軟籽石榴品種引種報道較少。

軟籽石榴抗寒性較弱，如突尼斯軟籽石榴1年生幼樹在溫度低于-10℃時易受凍害，樹齡2年以上時抗寒性增強(qiáng)[18]。突尼斯軟籽石榴原產(chǎn)于地中海沿岸，該地區(qū)為突尼斯軟籽石榴最適宜栽培區(qū)。我國以秦嶺—淮河為界，包括淮河中下游淮安、淮南、信陽一線以南及湖北、重慶、四川等?。ㄖ陛犑校┘耙阅系貐^(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，最低溫度高于-10℃，氣溫較為接近原產(chǎn)地，為突尼斯軟籽石榴適宜栽培區(qū)；秦嶺—淮河線以北，秦嶺—黃河—江蘇、山東省界以南，包括江蘇北部、安徽北部、河南黃河以南和陜西南部地區(qū)，突尼斯軟籽石榴可進(jìn)行露地栽培，但冬季需采取防凍保護(hù)措施，為次適宜栽培區(qū)；秦嶺—黃河—江蘇、山東省界以北，最低溫度低于-10℃以下低溫天數(shù)大于2 d，為不適宜栽培區(qū)[19]。突尼斯軟籽石榴引種到我國南方，表現(xiàn)良好，但因雨水多、空氣濕度大，出現(xiàn)授粉率、坐果率下降等問題[20]。因此，氣候條件是突尼斯軟籽石榴引種的關(guān)鍵問題，尤其是引種地的氣溫水平。

2 目前我國栽培的軟籽石榴品種

21世紀(jì)之前我國軟籽石榴栽培較少，產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。進(jìn)入21世紀(jì)，國內(nèi)各地區(qū)出現(xiàn)了軟籽石榴引種栽培高潮，相繼引種和培育了一批軟籽石榴新品種。以種子硬軟程度為依據(jù)，國內(nèi)鮮食石榴品種被劃分為3類：種子硬度小于3.67 kg/cm2為軟籽品種、種子硬度3.67～4.20 kg/cm2為半軟籽品種、種子硬度大于4.20 kg/cm2為硬籽品種[21]。雖然新品種的培育取得了一些成果，但總體進(jìn)程較慢，能在生產(chǎn)中作為主栽品種的新品種更少。品種培育是一項(xiàng)具有重要性、復(fù)雜性、嚴(yán)肅性和長期性的工作[22]，需要廣大科技人員的參與和共同努力，現(xiàn)階段軟籽石榴育種可向提高品種抗寒性的方向轉(zhuǎn)移。

國內(nèi)栽培品種有突尼斯軟籽[23]，中農(nóng)紅軟籽[24]，中石榴8號[25]，淮北軟籽1號、2號、3號[26]，紅如意軟籽，塔山軟籽[27]，棗選1號，紅瑪瑙籽[28]，紅玉石籽[29]，瑪麗斯[30]，白玉石籽[31]。以上品種均為國家或地方品種審定委員會審定品種，具體信息如下。

2.1 突尼斯軟籽

該品種8月上旬—9月上旬成熟。果實(shí)近圓球形，有棱肋，平均單果重406.3 g，最大單果重717.1 g。果皮光滑而薄。籽粒紅色，百粒重56.1 g，可食率61.7%，肉汁率91.3%，含糖量15.5%。栽植第2年即可見果，3年生產(chǎn)量約5.0 kg/株，4年生產(chǎn)量約11 550.0 kg/hm2，第5年進(jìn)入豐產(chǎn)期。樹勢中等、多枝、成枝力較強(qiáng)。幼嫩枝紅色，老枝褐色，側(cè)枝有卷曲現(xiàn)象，幼葉深紅色，葉狹長，橢圓形，枝刺深綠、不發(fā)達(dá)。耐旱、抗病，擇土不嚴(yán)，適應(yīng)范圍廣，抗寒性較差。

2.2 中農(nóng)紅軟籽

該品種9月上旬成熟。果實(shí)圓球形，平均單果重475.0 g，最大單果重1 250.0 g。果皮薄，明亮光潔，果面深紅色，裂果不明顯。籽粒紫紅色，百粒重66.4 g，出汁率87.8%，可溶性固形物15.20%。定植第2年產(chǎn)量約1.5 kg/株，3年生產(chǎn)量5.5 kg/株，4年生產(chǎn)量10.0 kg/株，5年生產(chǎn)量20.2 kg/株，盛果期產(chǎn)量可達(dá)22 500.0 kg/hm2。樹勢強(qiáng)健，幼樹干性不強(qiáng)，萌芽力較強(qiáng)，成枝力低，幼樹以中、長果枝結(jié)果為主，成齡樹長、中、短果枝均可結(jié)果。抗逆性強(qiáng)，耐旱，抗病性較好，擇土不嚴(yán)，適應(yīng)范圍廣，抗寒性稍差。

2.3 中石榴8號

該品種在河南鄭州9月下旬成熟。果實(shí)近圓形，平均單果重454.0 g。果皮光滑，著色好；果皮薄，有果棱，裂果不明顯。籽粒紅色，多汁，百粒重58.0 g，可溶性固形物15.5%，氨基酸7.52 g/kg，VC 12.9 mg/kg。定植5年單株結(jié)果數(shù)量55個，產(chǎn)量約20 250.0 kg/hm2。樹勢強(qiáng)健，樹姿開張。幼樹針刺發(fā)達(dá)，成年樹較少；樹干灰褐色。成枝力較強(qiáng)，幼樹以中、長果枝結(jié)果為主，成齡樹中、長、短果枝均可結(jié)果。早期豐產(chǎn)性強(qiáng)，綜合性狀較好，遺傳性狀穩(wěn)定，但抗寒性稍差。

2.4 淮北軟籽1號

該品種9月上旬即可采收，9月下旬完熟。果實(shí)近圓形，有棱肋。平均單果重324.8 g，最大果重650.0 g，百粒重72.6 g。果面光潔、皮薄。出汁率81.4%，總糖16.80%，總酸0.82%。壯苗定植，在集約條件下第2年即可見果，坐果率較高，3年生產(chǎn)量4.0 kg/株，6年生產(chǎn)量8.0 kg/株，10年生產(chǎn)量21 000.0 kg/hm2。樹勢中等，樹冠開張，主干有扭曲現(xiàn)象。嫩枝微紅色，有棱，枝刺不發(fā)達(dá)?？鼓嫘詮?qiáng)，適應(yīng)性廣，結(jié)果年限較長，經(jīng)濟(jì)效益較高。

2.5 淮北軟籽2號

該品種9月上旬即可采收，9月下旬完熟。果實(shí)近圓形，平均單果重294.1 g，最大單果重610.0 g。果皮光潔、稍厚。籽粒紅色，針狀透明，出籽率69.9%，百粒重61.5 g，出汁率78.2%，總糖19.00%，總酸0.75%，種核軟可食，品質(zhì)特佳。2年生即可部分結(jié)果，坐果率較高，3年生產(chǎn)量2.0 kg/株，5年生產(chǎn)量10.0 kg/株，盛果期產(chǎn)量22 500.0 kg/hm2。樹勢中等，樹冠較開張，干性較強(qiáng)，主干有扭曲現(xiàn)象。嫩枝微紅色，有棱，老枝枝刺發(fā)達(dá)。適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐瘠薄，對病蟲抗性較強(qiáng)，結(jié)果年限較長，豐產(chǎn)性好。

2.6 淮北軟籽3號

該品種9月上旬即可采收，9月下旬完熟。果實(shí)圓柱形，平均單果重267.3 g，最大單果重556.9 g。果皮薄。出汁率77.7%，籽粒透明，可見輻射狀晶體，百粒重64.5 g，總糖15.50%，總酸0.62%，種核綿軟，品質(zhì)佳。定植2年開花結(jié)實(shí)，坐果率較高，3年生產(chǎn)量2.0 kg/株，5年生產(chǎn)量6.0 kg/株，盛果期產(chǎn)量約21 000.0 kg/hm2。成枝力較強(qiáng)，主干有扭曲現(xiàn)象，枝刺不發(fā)達(dá)。耐旱、抗寒，較抗病，適應(yīng)范圍廣，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。

2.7 紅如意軟籽

該品種9月上旬成熟。果實(shí)近圓形，平均單果重474.9 g，最大單果重1 249.9 g。果皮薄而光亮，果面紅色。籽粒大而鮮紅，百粒重56.1 g，出籽率63.9%，可溶性固形物15.00%。風(fēng)味甘甜。栽植第1年部分可開花結(jié)果，第3年結(jié)果正常，第4年進(jìn)入豐產(chǎn)期，產(chǎn)量約30 000.0 kg/hm2。樹勢強(qiáng)健，樹冠半開張，枝條多，成枝力強(qiáng)。幼嫩枝紅色、有棱，老枝稍弱、枝梢卷曲，枝刺不發(fā)達(dá)。早期豐產(chǎn)性強(qiáng)?？共⌒院茫购詮?qiáng)，適應(yīng)范圍廣，擇土不嚴(yán)。

2.8 塔山軟籽

該品種9月中旬果實(shí)可食，9月下旬成熟。果實(shí)橢圓形，平均單果重370.0 g，最大單果重629.9 g，百粒重87.0 g，可食率63.9%，出汁率84.4%，可溶性固形物15.00%，總糖13.10%，VC 37.50 mg/kg。3年生產(chǎn)量10.0 kg/株，5年生產(chǎn)量24.0 kg/株，平均產(chǎn)量約22 200.0 kg/hm2。樹勢強(qiáng)健，樹冠開張，干性發(fā)達(dá)，主干深褐色，大樹主干有扭曲現(xiàn)象；嫩枝紫紅色，枝有棱，刺和萌蘗少?？共∠x害能力強(qiáng)，較抗裂果。

2.9 棗選1號

該品種9月下旬成熟，果實(shí)圓球形，平均單果重385.6 g，百粒重57.2 g。果皮光滑。籽粒均勻透明，長形，放射線明顯；可溶性固形物15.70%，籽仁柔軟可食。定植第2年即可見果，栽后第3年產(chǎn)量1.2 kg/株，第4年產(chǎn)量2.7 kg/株。樹冠自然圓頭形，樹姿開張。樹干灰褐色，有棱狀突起，葉狹長，較小。適應(yīng)范圍廣，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，抗病蟲害，且有一定抗寒性。

2.10 紅瑪瑙籽

該品種10月上旬成熟，果實(shí)近圓形，平均單果重301.1 g。籽粒呈馬齒狀，紅色，出汁率82.1%，可溶性固形物16.90%，總糖14.70%，VC 154.96 mg/kg。樹勢強(qiáng)健，枝條直立，成枝力不強(qiáng)，針刺硬，葉披針形?？共⌒院?，尤其抗褐斑病和干腐病，豐產(chǎn)性能好，適應(yīng)性較強(qiáng)。

2.11 紅玉石籽

該品種8月下旬可采收，9月中下旬成熟。果實(shí)扁圓形，有棱，平均單果重307.2 g，最大單果重366.6 g。果皮深紅色，表面光滑。籽粒淡黃，百粒重56.8 g，出汁率83.0%?？扇苄怨绦挝?5.40%，可溶性糖11.5%，總酸0.38%，VC 168.90 mg/kg，可食率55.70%。樹勢中等，萌發(fā)率高，成枝力弱，針刺不發(fā)達(dá)、稍軟。葉片披針形，葉小、色淡?？购?，不耐澇，抗病性好，豐產(chǎn)性好，適應(yīng)范圍較廣。

2.12 瑪斯麗

該品種9月中下旬成熟。果實(shí)近圓形，平均單果重510.5 g，最大單果重850.1 g。果皮光滑，表皮紅色，無裂果現(xiàn)象。籽粒紅色，粒大汁多，可溶性固形物16.00%。2年生產(chǎn)量2.2 kg/株，3年生產(chǎn)量7.3 kg/株，4年生產(chǎn)量17.7 kg/株。樹勢中庸，萌芽力強(qiáng)勁，大小年現(xiàn)象不明顯。

2.13 白玉石籽

該品種9月中下旬成熟，果實(shí)近圓形，平均單果重468.9 g。果皮淺黃色，表面光滑，有果棱。籽粒多呈馬齒狀，百粒重84.3 g，出汁率81.4 %，可溶性固形物16.40%，可溶性糖12.61%，有機(jī)酸0.31%，VC 149.70 mg/kg。盛果期產(chǎn)量達(dá)60.0 kg/株。樹姿張開。枝條韌性好，枝皮淺白色，莖刺不發(fā)達(dá)。葉片披針形，深綠色，葉尖稍尖?？共⌒院茫m應(yīng)性較強(qiáng)。采前裂果較少，果實(shí)耐貯運(yùn)，無大小年現(xiàn)象。

3 栽培技術(shù)

軟籽石榴的生產(chǎn)受多方面因素的影響，如土壤[32]、氣溫、科學(xué)管理等，適宜的生長條件和科學(xué)管理可以提高軟籽石榴產(chǎn)量及品質(zhì)。在生產(chǎn)中，選擇適合的土壤，并采用科學(xué)的水肥管理能夠提高石榴質(zhì)量[32]；軟籽石榴扦插苗在不同基質(zhì)的生產(chǎn)狀況不同，以秸稈腐熟物∶珍珠巖∶蛭石=5∶2∶3 配方的基質(zhì)扦插苗成活率最高[33]；花期采用赤霉素對軟籽石榴花進(jìn)行處理，可以促進(jìn)軟籽石榴坐果率、產(chǎn)量及果實(shí)綜合品質(zhì)的提升，以10 mg/L和20 mg/L 濃度的赤霉素處理效果最好[34]。結(jié)果期，及時套袋和去袋，可以顯著提高果實(shí)質(zhì)量，增加果農(nóng)收入[35]；果實(shí)采后貯藏時，低溫氣調(diào)貯藏可以有效地抑制貯后貨架期間果實(shí)表皮褐變和呼吸代謝，減少損失，改善貯后果實(shí)風(fēng)味，增加收益。以2% O2+8% CO2氣調(diào)貯藏效果最佳[36]；用于貯藏的軟籽石榴應(yīng)適當(dāng)早采，此舉既可延長軟籽石榴的貯藏壽命，又能延緩品質(zhì)的劣變[37]。

軟籽石榴抗寒性較弱，科學(xué)合理的防寒措施可以減輕凍害對果樹的影響。軟籽石榴抗寒性弱于傳統(tǒng)石榴品種，用LT50 評價石榴抗寒性是具有較高可行性和準(zhǔn)確性的方法[38]。通過對凍害現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，位于地勢偏低的1～2年生的石榴園凍害現(xiàn)象最為嚴(yán)重，5年以上生石榴園干腐病發(fā)病最嚴(yán)重，且干腐病發(fā)生與石榴園凍害程度具有一定相關(guān)性[39]。研究發(fā)現(xiàn)，采用將石榴的地上部分彎折全部埋土、嫁接抗寒砧木、綁玉米秸加蓋棉被、擋風(fēng)墻或防護(hù)林、蓋草等物理措施可以有效減輕果樹凍害，其中以石榴的地上部分彎折全部埋土的措施最為顯著；落葉前噴施PP333和KH2PO4（至少3次）亦可防治凍害；物理與化學(xué)保護(hù)措施相結(jié)合防治凍害效果更為顯著[40]。

4 組織培養(yǎng)技術(shù)

近年來，軟籽石榴的種植面積不斷擴(kuò)大。然而，優(yōu)質(zhì)種苗的短缺、品種良莠不齊等因素嚴(yán)重限制軟籽石榴產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[41]。常規(guī)的繁殖方法周期長、產(chǎn)量小、質(zhì)量差，不能滿足市場需求[42]，組織培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)提供了解決這些難題的途徑。

4.1 不同外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)

軟籽石榴外植體的選擇主要為幼胚[43-44]、1年生或多年生新梢的莖段[43，45]、莖尖[42]和葉片[45-46]。突尼斯軟籽石榴幼胚最適宜接種時期為8月中下旬—9月初，用0.025% HgCl25 min+50% NaClO 5 min 將其籽粒進(jìn)行滅菌，污染率最低[44]。吳亞君[47]用突尼斯軟籽種子進(jìn)行胚培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)對種子消毒較好的方法為：8月中旬后采摘的果實(shí)采用5% NaClO 浸泡30 min，成熟后采收并貯藏1年的果實(shí)采用1% HgCl2浸泡8 min；發(fā)芽率較高的催芽方法是：5% NaClO 浸泡15 min，（25±2）℃培養(yǎng)7 d；并得到了上下胚軸、子葉的再生不定芽、不定芽伸長和生根最適培養(yǎng)基；而且證明下胚軸的再生能力最強(qiáng)，上胚軸次之，子葉最弱，但對農(nóng)桿菌侵染耐受性為子葉最強(qiáng)，下胚軸次之，上胚軸最弱。果實(shí)在4℃下貯存4 d，除去部分種皮有利于胚萌發(fā)[43，48]，原因可能是低溫處理提高了發(fā)芽勢，使種子提前發(fā)芽；胚萌發(fā)后的增殖培養(yǎng)中，植物激素對增殖的影響程度為6-BA最強(qiáng)，NAA次之，GA3相對較弱[48]。

何寧等[49]以突尼斯軟籽石榴莖段為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究表明，IAA、BA和KT 3種生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織和芽誘導(dǎo)率的影響很大，效果為IAA>BA>KT，并得到了愈傷組織誘導(dǎo)、芽誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。張曉申等[50]以突尼斯軟籽石榴的莖段為外植體進(jìn)行組培快繁，研究發(fā)現(xiàn)，外植體最佳采集時間為3—4月，最佳殺菌處理采用70%酒精浸泡30 s，0.1%的升汞浸泡2.5 min，并得到最佳啟動、增殖和生根培養(yǎng)基。河陰軟籽石榴莖段的最佳誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基也已經(jīng)獲得[51]。閆志佩[42]對軟籽石榴莖尖生長錐進(jìn)行組織培養(yǎng)，試驗(yàn)得到了合適的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。彭麗萍等[45]對軟籽石榴離體葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)，MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，選擇葉片中部或葉片基部為外植體時，可以顯著提高誘導(dǎo)率。陳延惠等[52]對突尼斯軟籽石榴的葉片進(jìn)行再生體系研究，得出其最適宜的暗培養(yǎng)時間為14 d，以及最適宜愈傷組織分化、不定芽分化、莖段增高培養(yǎng)基。

4.2 外植體褐化抑制的研究

在軟籽石榴組織培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)褐化，如何抑制褐變是組織培養(yǎng)獲得成功亟待解決的難題[53]。彭麗萍等[45]研究表明，葉片組織培養(yǎng)時其消毒最適宜的時長為7～9 min，10 d 轉(zhuǎn)接1次可有效降低褐化；使用MS+5 g/L 瓊脂+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖+PVP 2 g/L可使褐變率顯著降低，并可提高愈傷誘導(dǎo)率。李林瑜等[54]研究發(fā)現(xiàn)，接種后進(jìn)行暗處理可有效遏制褐變，可能與暗處理降低了某些酶的活性、降低了酚類物質(zhì)溢出有關(guān)?？购謩㏄VP 對降低石榴外植體褐化有極顯著作用，且PVP在濃度為2 500 mg/L時，外植體褐化率最低[42，45]。

4.3 培養(yǎng)基類型的研究

軟籽石榴莖段初代培養(yǎng)中MS 培養(yǎng)基明顯優(yōu)于WPM 培養(yǎng)基，但對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，WPM 培養(yǎng)基的誘導(dǎo)成活率為MS的4.09倍[54]。這可能是不同外植體對養(yǎng)分的需求不同，MS和WPM 培養(yǎng)基養(yǎng)分含量不同，WPS 培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度較低，而且含有K2SO4；也可能是不同外植體內(nèi)源激素水平差異所致。

5 分子生物學(xué)技術(shù)

分子標(biāo)記在分子遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、基因定位與克隆、種子資源等方面應(yīng)用廣泛。常用的分子標(biāo)記方法包括AFLP、SSR、SNP 等，這些方法在軟籽石榴上的應(yīng)用也得到了發(fā)展。

5.1 分子標(biāo)記

鞏雪梅[55]對50個石榴品系的基因進(jìn)行研究，得到了它們的指紋圖譜，并獲得了16個品種獨(dú)有的特異性譜帶，可作為品種鑒別的分子標(biāo)記。楊健[56]對紅瑪瑙籽品種的成熟籽粒進(jìn)行研究，得到了179個SSR位點(diǎn)，EST-SSR 出現(xiàn)頻率為19.7%，并得出不同物種間的SSR 信息差異較大的結(jié)論。薛輝[57]對三白石榴和突尼斯軟籽石榴種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到132 287條轉(zhuǎn)錄本序列，105 743條有代表性的Unigenes 序列，76 806條完整的蛋白編碼序列和多個SSR。

5.2 功能基因

研究人員通過農(nóng)桿菌浸染法將耐寒基因ICE1、ICE2 轉(zhuǎn)入突尼斯軟籽石榴愈傷組織，得到轉(zhuǎn)基因抗性苗，并證明EHA105 菌株的污染率和褐化率低于LBA4404 菌株[58]。對26個石榴品種的種子硬度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同品種之間種子硬度存在極顯著差異；即使同一品種樹冠的不同部位，也存在顯著差異[55]。這說明石榴種子硬度的遺傳狀況非常復(fù)雜，推測石榴種子的硬度可能由多個基因協(xié)調(diào)控制。通過軟、硬籽石榴品種比較，發(fā)現(xiàn)籽粒的硬度與木質(zhì)素和纖維素含量相關(guān)，主要由木質(zhì)素相關(guān)基因和纖維素相關(guān)基因控制[57]。籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量呈正相關(guān)[59-60]，這與PgCOMT 基因的相對表達(dá)一致[59]，與PgMYB的相對表達(dá)負(fù)相關(guān)[60]，推測可能是該基因?qū)κ穹N皮木質(zhì)素的生物合成起抑制作用。對石榴PgMYB308 基因的時空表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果，PgMYB308 基因可能是木質(zhì)素合成的負(fù)調(diào)控因子[61]，與木質(zhì)素合成相關(guān)的酶基因同樣參與木質(zhì)素合成的調(diào)控，如CCR、CCo A-OMT、PAL 等[57]。研究發(fā)現(xiàn)，在木質(zhì)素生物合成途徑中CCR可能對碳流具有潛在的調(diào)控作用[62]，推測其可能在木質(zhì)素合成途徑中起著重要作用。董麗麗等[63]克隆了石榴PgCCR 基因并對其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在紅玉石籽品種中的表達(dá)水平較高，而在會理軟籽與突尼斯軟籽品種中的表達(dá)水平較低，得出PgCCR 基因表達(dá)水平與木質(zhì)素合成有一定相關(guān)性的結(jié)論，這說明PgCCR 基因可能在籽粒木質(zhì)素合成中起關(guān)鍵作用。對不同時期籽粒Pg4CL基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Pg4CL 基因的表達(dá)量升降趨勢與木質(zhì)素合成總量一致；但對不同品種籽粒中的相對表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，在會理軟籽和突尼斯軟籽品種中的表達(dá)量與籽粒硬度及木質(zhì)素含量趨勢不同，這說明Pg4CL 基因在石榴木質(zhì)素的合成中起重要作用，但并不是決定不同品種間石榴籽粒木質(zhì)素含量的唯一因素，而其表達(dá)可能受其他基因及樹體本身激素的影響[64]。Pg4CL、PgCAD、PgC4H和PgCCoAOMT 基因在6個品種的石榴籽粒中均有表達(dá)，但在突尼斯軟籽品種中的表達(dá)相對較高，且在另5個品種的相對表達(dá)量與籽粒種皮總木質(zhì)素含量呈正相關(guān)[65]。

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序，研究人員挖掘出了9個影響石榴花敗育的關(guān)鍵調(diào)控基因，包括：3個AGAMOUS同源基因、1個SPL 同源基因、2個ANT 同源基因、1個INO 同源基因、2個乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因ETR和ERF1/2 候選基因[66]。陳利娜等[67]從突尼斯軟籽石榴中克隆了雌蕊敗育相關(guān)基因PgAGL11，并證明其可能在石榴雌蕊敗育過程中起重要作用。

5.3 蛋白組學(xué)技術(shù)

研究人員應(yīng)用差異蛋白組學(xué)、雙向電泳和MALDI-TOF-TOFMS 質(zhì)譜鑒定技術(shù)研究三白石榴和中農(nóng)紅軟籽石榴成熟果實(shí)果皮蛋白組學(xué)差異，結(jié)果表明，葉綠素a/b 結(jié)合蛋白（sport 5108）、細(xì)胞色素b6-f 復(fù)合體（sport 0013）和果糖激酶2-like（sport 0503）可能與果皮顏色變化相關(guān)；半胱氨酸合酶1（sport 1402）可能對提高石榴的抗氧化脅迫能力起到了重要作用[68]。牛娟等[69]利用iTRAQ 技術(shù)分析軟籽石榴與硬籽石榴在籽粒硬度形成過程中蛋白表達(dá)豐度的差異，發(fā)現(xiàn)在籽粒發(fā)展過程中，數(shù)個蛋白涉及次生細(xì)胞壁生物合成與降解，如F5H、XYL、Elongationfactor 1-beta、Elongationfactor 1-delta及Profilin 等。這些研究結(jié)果為果實(shí)發(fā)育蛋白組學(xué)研究和闡明石榴籽粒軟硬形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

6 展望

軟籽石榴品種優(yōu)良的性狀深受人們喜愛，在我國的發(fā)展?jié)摿薮?，市場前景廣闊。國內(nèi)軟籽石榴種質(zhì)資源有限，雖然有一定的研究基礎(chǔ)，但是育種工作仍然進(jìn)展緩慢。與普通石榴品種相比，軟籽石榴品種抗性較弱。因此，育種時在保持品種優(yōu)良性狀條件下要以增強(qiáng)抗性為主。同時，應(yīng)采用新技術(shù)、多途徑的方法加強(qiáng)品種培育。對于優(yōu)良品種，可加大在國內(nèi)的示范推廣力度，擴(kuò)大栽培面積，增加經(jīng)濟(jì)效益。隨著時代的進(jìn)步，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展也應(yīng)與時俱進(jìn)，豐富軟籽石榴種質(zhì)基因庫，探索其遺傳多樣性、生理機(jī)制、遺傳育種等工作的深入展開將會對我國軟籽石榴的研究產(chǎn)生積極影響。