宋海紅 畢 瀅 何欒櫻 閆培麗 安文林 喻長遠(yuǎn)* 王詩卉,2*

(1. 北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029;2. 北京化工大學(xué) 秦皇島環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院, 秦皇島 066000)

引 言

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F),系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物,別名黃藤、黃藤木、黃臘藤、斷腸草等,分布于中國長江流域以南各地及西南地區(qū)[1]。 雷公藤作為一種傳統(tǒng)中藥,其味苦,有大毒,具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲止血等功效[2]。 藥理及臨床研究證實(shí),雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗生育等多種特性,被廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病及各種皮膚病[3]。 雷公藤甲素與雷公藤紅素是雷公藤中有效以及毒性成分。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的常駐免疫細(xì)胞和吞噬細(xì)胞[4],各種神經(jīng)退行性疾病,包括帕金森病(Parkinson's disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)和肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS),最顯著的共同特征之一是小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[5]。 神經(jīng)炎癥現(xiàn)在被認(rèn)為是一把雙刃劍,對神經(jīng)元既有害又有益。越來越多的證據(jù)表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化是不均勻的,可以分為兩種相反的類型:促炎的M1 表型和免疫抑制的M2 表型。 M1 激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子,驅(qū)動細(xì)胞浸潤,而M2 激活的小膠質(zhì)細(xì)胞更具有修復(fù)性,促進(jìn)碎片的吞噬作用,促進(jìn)與細(xì)胞穩(wěn)定性和修復(fù)相關(guān)的蛋白的表達(dá)[6]。

雷公藤提取物已被報道對多種炎癥和自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效。 雷公藤甲素和雷公藤紅素被認(rèn)為是雷公藤免疫抑制和抗炎作用的主要成分。 越來越多的資料表明,雷公藤甲素和雷公藤紅素對多種組織具有很強(qiáng)的抗炎作用[4]。

本實(shí)驗(yàn)主要探究雷公藤甲素與雷公藤紅素對小膠質(zhì)細(xì)胞HMO6 的影響,包括它們對細(xì)胞增殖、細(xì)胞膜完整性以及雷公藤甲素對小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2極化的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雷公藤甲素、雷公藤紅素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,人白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA 試劑盒和人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA 試劑盒購自默沙克生物技術(shù)有限公司,小膠質(zhì)細(xì)胞(HMO6)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(SW-CJ-1D,蘇州凈化設(shè)備有限公司),離心機(jī)(Heraeus Pico 17,Thermo Fisher 公司),酶聯(lián)免疫檢測儀(K3 Plus,BIO-DL 公司),恒溫培養(yǎng)箱(311,Thermo Fisher 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HMO6 于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,溫度37 ℃),隔1 ～2 d 傳代1 次,選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

按MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書操作,收集對數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,分于96 孔板,每孔180 μL,8 000 個細(xì)胞/孔。 置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜使細(xì)胞貼壁[8]。 不同濃度雷公藤甲素或雷公藤紅素處理的細(xì)胞孔設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞孔為對照組,無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔為空白組。 將96 孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h,小心吸去上清,加入90 μL 新鮮培養(yǎng)基,再加入10 μL MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 然后吸掉上清,每孔加入110 μL Formazan 溶解液,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。 在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm 波長處測量各孔的光密度(OD)值。 按照式(1) ～(2)計算細(xì)胞活力(A)和抑制率(B)。

式中,A 為細(xì)胞活力,B 為細(xì)胞抑制率,ODE為實(shí)驗(yàn)組光密度值,ODB為空白組光密度值,ODC為對照組光密度值。

1.2.3 膜完整性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒進(jìn)行HMO6 細(xì)胞膜完整性的評估[9]。 乳酸脫氫酶(LDH)是一種較為穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶,不能自由通過細(xì)胞膜,但當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞死亡時可逃離出細(xì)胞膜,被釋放到細(xì)胞外。 LDH 釋放被看做是評價細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo),并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測。

按說明書操作,收集對數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,分于96 孔板,每孔180 μL,8 000 個細(xì)胞/孔。 置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜使細(xì)胞貼壁。 然后吸去培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2 ～7.4)洗滌一次,換新鮮培養(yǎng)基(含1%血清的低血清培養(yǎng)液)200 μL,將各培養(yǎng)孔分為如下幾組:對照組(未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞孔),空白組(無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔),樣品最大酶活性對照組(未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔),實(shí)驗(yàn)組(藥物處理的細(xì)胞孔)。 按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)濃度的藥物(雷公藤甲素與雷公藤紅素)處理,繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。 培養(yǎng)23 h 后,從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板,在樣品最大酶活性對照孔中加入試劑盒提供的LDH 釋放試劑20 μL。 加入LDH 釋放試劑后,反復(fù)吹打數(shù)次混勻,繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,然后用無菌管收集各孔液體并離心,分別取各孔的上清液120 μL,加入到一新的96 孔板相應(yīng)孔中,各孔加入LDH 檢測工作液60 μL,混勻后在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm 波長處測量各孔的光密度值,并用600 nm 的波長作為參考波長。按照式(3)計算細(xì)胞LDH 的釋放量。

式中,C 為LDH 釋放量(陽性對照的百分比),ODF為樣品最大酶活性對照孔的光密度值。

1.2.4 ELISA 實(shí)驗(yàn)

通過ELISA 試劑盒檢測雷公藤甲素對小膠質(zhì)細(xì)胞的M1、M2 極化的影響,實(shí)驗(yàn)中LPS 質(zhì)量濃度為0.15 μg/mL。 設(shè)置對照組(未加LPS 和雷公藤甲素的細(xì)胞孔),實(shí)驗(yàn)組(LPS 和不同濃度雷公藤甲素處理的細(xì)胞孔)和LPS 組(LPS 處理的細(xì)胞孔)。 將經(jīng)過處理的細(xì)胞用無菌管收集,于2 000 ～3 000 r/min 離心20 min 左右,仔細(xì)收集上清后使用試劑盒檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 統(tǒng)計軟件分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示,樣本均數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析,P ＜0.05 說明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細(xì)胞活力的影響

通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細(xì)胞活力的影響,雷公藤甲素選取0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 7 個濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),雷公藤紅素選取0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L 7 個濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 為雷公藤甲素對HMO6 細(xì)胞活力的影響,與對照組相比,當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-10mol/L 時對HMO6 細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用(P ＞0.05,n=5),抑制率為(0.70 ±4.00)%;當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-9～10-5mol/L 時對HMO6 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P ＜0.01,n =5),且細(xì)胞活性隨雷公藤甲素濃度升高逐漸降低;當(dāng)藥物濃度達(dá)到10-7mol/L 時,抑制率為(68.51 ±2.09)%,與文獻(xiàn)基本一致[10],繼續(xù)增大藥物濃度,細(xì)胞活性將進(jìn)一步降低。

圖2 為雷公藤紅素對HMO6 細(xì)胞活力的影響,與對照組相比,雷公藤紅素在濃度為0 ～10-6mol/L時對HMO6 細(xì)胞增殖并無明顯的抑制作用(P ＞0.05,n=5);當(dāng)藥物濃度達(dá)到10-5mol/L 時,HMO6細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P ＜0.01,n =5),抑制率為(60.53 ±18.56)%;當(dāng)藥物濃度達(dá)到10-4mol/L 時,抑制率為(71.91 ±16.28)%。

綜上所述,可以發(fā)現(xiàn)一定濃度的雷公藤甲素(10-9～10-5mol/L)與雷公藤紅素(10-5、10-4mol/L)對HMO6 的活性有顯著的影響,下文進(jìn)一步探索抑制的分子機(jī)制。

2.2 雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細(xì)胞膜完整性的影響

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細(xì)胞膜是否具有破壞作用。雷公藤甲素選取0、10-7、10-4、10-3、10-1mol/L 5個濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),雷公藤紅素選取0、10-7、10-6、10-5mol/L 4 個濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 為不同濃度的雷公藤甲素處理細(xì)胞后LDH 的釋放量,與對照組相比,雷公藤甲素處理的細(xì)胞LDH 釋放量并無明顯變化(P ＞0.05,n =4),說明雷公藤甲素對細(xì)胞膜無明顯的破壞作用。

圖4 為不同濃度的雷公藤紅素處理細(xì)胞后LDH 的釋放量,與對照組相比,當(dāng)雷公藤紅素濃度為10-5mol/L 時,LDH 釋放量明顯增加(P ＜0.01,n=4),增加量為(8.58 ±1.56)%,與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本保持一致,說明當(dāng)雷公藤紅素濃度達(dá)到10-5mol/L 時,細(xì)胞膜明顯受到破壞。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:雷公藤甲素(10-7～10-1mol/L)不會破壞HMO6 細(xì)胞膜完整性,而當(dāng)雷公藤紅素濃度達(dá)到10-5mol/L 時會破壞HMO6 細(xì)胞膜的完整性。

2.3 雷公藤甲素對HMO6 細(xì)胞M1、M2 極化的影響

由2.2 節(jié)實(shí)驗(yàn)可知,雷公藤紅素可通過破壞細(xì)胞膜的方式影響細(xì)胞活性。 而雷公藤甲素對HMO6細(xì)胞膜并無明顯破壞作用,所以進(jìn)一步探究其是否對HMO6 細(xì)胞極化有影響,用雷公藤甲素處理經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的HMO6 細(xì)胞,然后選擇TNF-α 作為衡量M1 型極化的指標(biāo)、IL-10 作為衡量M2 型極化的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)選取4 個不同濃度的雷公藤甲素進(jìn)行測試,探究當(dāng)雷公藤甲素濃度為0、10-9、10-8、10-7mol/L 時對HMO6 細(xì)胞M1、M2 極化的影響。

圖5 為雷公藤甲素對LPS 誘導(dǎo)的HMO6 細(xì)胞釋放TNF-α 的影響,與LPS 組相比,當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時,TNF-α 釋放量顯著減少(P ＜0.01,n=3);當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-8mol/L時,TNF-α 釋放量為(521.24 ±30.07)pg/mL;當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-7mol/L 時,TNF-α 釋放量為(264.83 ±64.25)pg/mL。

圖6 為雷公藤甲素對LPS 誘導(dǎo)的HMO6 細(xì)胞釋放IL-10 的影響,與LPS 組相比,當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時,IL-10 釋放量顯著減少(P ＜0.05,n=3);當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-8mol/L時,IL-10 釋放量為(70.20 ±21.81)pg/mL;當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-7mol/L 時,IL-10 釋放量為(63.48 ±16.79)pg/mL。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2 的極化,結(jié)果表明了雷公藤甲素作用機(jī)制的復(fù)雜性,與文獻(xiàn)結(jié)果一致[11-12]。

3 結(jié) 論

當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-9～10-5mol/L 時對小膠質(zhì)細(xì)胞活性有一定的抑制作用;當(dāng)濃度為10-7～10-1mol/L 時對細(xì)胞膜完整性無明顯破壞作用;通過ELISA 實(shí)驗(yàn)可知,當(dāng)雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時,對LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-10 的釋放有抑制作用,說明雷公藤甲素雖然起到了一定的抗炎作用,但由于其特殊毒性,作用機(jī)理十分復(fù)雜。 當(dāng)雷公藤紅素濃度達(dá)到10-5mol/L 時明顯抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,并且通過破壞細(xì)胞膜的方式發(fā)揮作用。

作為雷公藤的有效提取物,雷公藤甲素與雷公藤紅素在神經(jīng)免疫性疾病的治療中發(fā)揮了重要作用,可能作為治療神經(jīng)性疾病的有效藥物,但其特殊的毒副作用也應(yīng)受到高度重視。