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      同位素內(nèi)標-氣相色譜-質(zhì)譜法測定食用植物油中縮水甘油酯

      2020-12-15 09:42:28張方圓王李平朱大林潘云山
      中國油脂 2020年12期
      關(guān)鍵詞:丙醇植物油正己烷

      張方圓,王李平,朱大林,潘云山

      (廣東省科學(xué)院 廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心),廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室,廣東省保健食品功效成分檢測與風(fēng)險物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心,廣州 510070)

      縮水甘油酯(Glycidyl esters,GEs)是縮水甘油和脂肪酸的酯化產(chǎn)物。GEs在人體中會代謝為縮水甘油(又稱環(huán)氧丙醇),在2017年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)公布的致癌物清單中,縮水甘油被列入了2A類致癌物清單。動物實驗證明縮水甘油具有致癌作用,食用后容易對人體中樞神經(jīng)產(chǎn)生抑制作用,可能損害生育能力甚至致癌[1]。另外,縮水甘油在氯離子和酸性條件下,易轉(zhuǎn)換成氯丙醇,以3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)為主,而3-MCPD 具有腎毒性、生殖毒性和致癌性[2],對人體健康產(chǎn)生巨大的威脅。

      GEs已成為一種潛在的食品污染物,并引起了社會各界的廣泛關(guān)注[3]。2016年,歐盟(EFSA)對GEs和氯丙醇酯類化合物對人類健康進行了風(fēng)險評估,結(jié)果表明絕大多數(shù)植物油中均含有GEs和氯丙醇酯,并制定了氯丙醇的每日許可限量(TDI)值為0.8 μg/kg[4]。2018年,歐盟實施了對植物油和嬰幼兒奶粉中GEs的限量管理[5]。目前,我國缺少食品中GEs的相關(guān)檢測方法和標準,文獻報道的方法主要分為直接法和間接法兩類。直接法主要應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS),在不破壞GEs結(jié)構(gòu)的條件下,對各類GEs進行直接測定[6-7],但由于GEs種類較多,多種標準品還未商業(yè)化,導(dǎo)致標準品造價昂貴,且難以購得。間接法多采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS),將GEs轉(zhuǎn)化為其他特異性的物質(zhì),通過檢測該物質(zhì)的含量間接測定GEs的含量[8-9]。《2018年國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》采用間接法測定GEs的含量,將GEs經(jīng)酯交換反應(yīng)后,與氯離子反應(yīng)生成氯丙醇,通過氯丙醇的差值折算得到GEs的含量。間接法適用于測定GEs的總量,但由于GEs和氯丙醇酯的形成機理相似,氯丙醇酯通常伴隨GEs一起形成,GEs不是氯丙醇形成的唯一前體,且食品中存在氯丙醇本底值的干擾情況[10]。因此,通過將GEs轉(zhuǎn)化成氯丙醇間接測定GEs含量時,需先測定樣品中氯丙醇及其酯的本底值,再測定樣品中經(jīng)GEs轉(zhuǎn)化而來的氯丙醇和樣品本身氯丙醇及其酯的總含量,通過計算氯丙醇含量的差值得到GEs的含量。這加大了實驗工作量和實驗所需樣品量,且本底值測定的準確性會直接影響測定結(jié)果的準確性。

      本研究采用間接法將GEs轉(zhuǎn)化成3-溴-1,2-丙二醇(3-MBPD)酯,再通過水解和衍生化前處理方法,采用GC-MS測定3-MBPD含量,從而實現(xiàn)對食用植物油中GEs的測定,并通過正交實驗對衍生條件進行優(yōu)化。溴丙醇和氯丙醇結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似,且樣品中不存在溴丙醇本底值干擾的情況,因此本方法可以通過測定溴丙醇含量直接得到GEs的含量,降低了樣品中基質(zhì)干擾,克服了氯丙醇本底值干擾,提高了檢測的靈敏度和準確性,且減少了測定工作的樣品需求量,可以更好地滿足食用植物油中GEs含量的測定要求。

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      1.1.1 原料與試劑

      食用植物油樣品均購于廣州市各大超市;棕櫚酸縮水甘油酯(GEs, 98.0%,BePure),棕櫚酸-D5-3-氯-1,2-丙二醇酯(D5-3-MCPDE,100 μg/mL,F(xiàn)irst Standard);正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、三氯甲烷均為色譜純;苯硼酸(PBA,97.0%,麥克林);實驗用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水;其他試劑均為分析純。

      GEs標準儲備液:準確稱取棕櫚酸縮水甘油酯標準品0.011 11 g(精確至0.000 01 g),用三氯甲烷配制成1 089 μg/mL的儲備液,臨用時用三氯甲烷稀釋成所需質(zhì)量濃度。

      內(nèi)標棕櫚酸-D5-3-氯-1,2-丙二醇酯溶液:準確移取適量棕櫚酸- D5-3-氯-1,2-丙二醇酯標準品,用乙酸乙酯配制成10 μg/mL的內(nèi)標溶液。

      1.1.2 儀器與設(shè)備

      Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫科技有限公司;Sartorius BT125D 電子天平;TD25-WS多管架自動平衡離心機;KQ-600E超聲波清洗儀;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋;0XW-80A旋渦混合器。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 樣品前處理

      稱取植物油樣品0.2 g(精確至0.000 1 g)于10 mL比色管中,準確加入20 μL內(nèi)標溶液,再加入2 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯溶液(體積比2∶1),渦旋溶解,作為待反應(yīng)液。

      向待反應(yīng)液中加入酸化溴化鈉溶液0.1 mL,渦旋混勻,在50℃水浴反應(yīng)15 min;加入3 mL飽和碳酸氫鈉溶液中止反應(yīng),并加入2 mL正己烷,渦旋,靜置,取上清液于10 mL比色管中,用正己烷重復(fù)提取上清液2次,合并提取液于10 mL比色管中,40℃氮吹至近干,加入1 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯溶液(體積比2∶1)復(fù)溶,備用。

      于上述提取液中加入2 mL 1.8%硫酸-甲醇溶液,混合均勻后,置于40℃恒溫水浴中反應(yīng)16~20 h。加入3 mL飽和碳酸氫鈉溶液中止反應(yīng)后,渦旋,靜置分層,氮吹除去有機溶劑。再用2 mL正己烷除去反應(yīng)液中的脂溶物,棄上層液,正己烷重復(fù)脫脂2次,得到下層清液備用。

      加入1.0 mL乙酸乙酯于上述清液中,渦旋提取1 min,取上層液于裝有1 g無水硫酸鈉的10 mL比色管中,重復(fù)提取2次,合并提取液,于40℃氮吹吹干。

      加入適量PBA溶液,振蕩均勻后,于恒溫水浴反應(yīng)一段時間,冷卻,40℃氮吹至近干,加入1 mL正己烷,渦旋溶解,轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中,待測定。

      1.2.2 標準曲線的繪制

      將GEs標準儲備液稀釋得到質(zhì)量濃度為1.089 μg/mL標準溶液,分別移取GEs標準溶液20、50、100、200、500、1 000、2 000 μL于10 mL比色管中,并分別加入內(nèi)標溶液20 μL,按1.2.1在酸性條件下與溴離子反應(yīng)后,經(jīng)1.8%硫酸-甲醇水解,乙酸乙酯提取,于40℃氮吹吹干后,按優(yōu)化后的衍生條件衍生化,得到目標物3-MBPD-PBA質(zhì)量濃度依次為0.021 8、0.054 4、0.109、0.218、0.544、1.089、2.178 μg/mL,內(nèi)標質(zhì)量濃度為0.200 μg/mL,然后進行GC-MS分析,以目標物峰面積與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標,3-MBPD-PBA質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

      1.2.3 GC-MS分析條件

      GC條件:色譜柱為DB-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);進樣口溫度280℃;升溫程序為60℃保持0 min,以6℃/min速率升溫至180℃,再以60℃/min速率升溫至300℃,保持3 min;進樣方式為脈沖不分流;進樣量1 μL。

      MS條件:電子轟擊離子源(EI);電離能量70 eV;離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃,傳輸線溫度280℃;掃描方式為選擇離子掃描(SIM);溶劑延遲6 min;定量及定性離子見表1。

      表1 3-MBPD-PBA、D5-3-MCPD-PBA的監(jiān)測離子

      2 結(jié)果與討論

      2.1 3-MBPD和D5-3-MCPD衍生物的定性分析

      本實驗中,GEs和內(nèi)標D5-3-MCPDE在酸性條件下與溴離子反應(yīng)后,經(jīng)硫酸-甲醇水解后生成3-MBPD和D5-3-MCPD。3-MBPD和D5-3-MCPD在PBA用量100 μL、衍生溫度50℃、衍生時間10 min條件下與PBA衍生后生成3-MBPD-PBA和D5-3-MCPD-PBA。衍生產(chǎn)物在GC-MS分析條件下,經(jīng)全掃描模式分析后,得到相應(yīng)的總離子流圖和質(zhì)譜圖,如圖1所示。

      圖1 2.178 μg/mL 3-MBPD、2.000 μg/mL D5-3-

      從圖1A可以看出,3-MBPD-PBA和D5-3-MCPD-PBA在該GC-MS分析條件下的出峰時間分別為19.4 min和17.6 min,兩種物質(zhì)的響應(yīng)較好,且分離度良好。從圖1B、圖1C可以看出:D5-3-MCPD-PBA的特征離子為m/z150.1、201.0、93.0,其中m/z150.1的響應(yīng)最高;3-MBPD-PBA 的特征離子為m/z147.1、240.0、91.0,其中m/z147.1的響應(yīng)最高。因此,可采用選擇離子監(jiān)測模式對D5-3-MCPD-PBA和3-MBPD-PBA進行定性分析,以降低噪聲和其他干擾效應(yīng),提高檢測靈敏度。其中:D5-3-MCPD-PBA定量離子m/z150,定性離子m/z201、93;3-MBPD-PBA定量離子m/z147,定性離子m/z240、91。

      2.2 衍生條件的優(yōu)化

      采用正交實驗對3-MBPD與PBA的衍生反應(yīng)條件進行優(yōu)化。通過分析實驗條件和前期單因素實驗,在GEs質(zhì)量濃度為21.78 μg/mL條件下,以PBA用量、衍生溫度和衍生時間為因素,3-MBPD-PBA峰面積為指標進行正交實驗設(shè)計。正交實驗設(shè)計和結(jié)果見表2,方差分析見表3。

      表2 正交實驗設(shè)計和結(jié)果

      表3 方差分析

      從表2可以看出,各因素對3-MBPD-PBA峰面積影響的主次順序為A>C>B,最佳因素水平組合為A1B2C2,即PBA用量為100 μL,衍生溫度為50℃,衍生時間為10 min。

      從表3可以看出,各因素對3-MBPD-PBA峰面積影響的主次順序為A>C>B,與極差分析結(jié)果一致。因素A和因素C對響應(yīng)值有顯著性影響(P<0.05)。

      2.3 標準曲線與檢出限

      GEs在0.021 8~2.178 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的標準工作曲線方程為y=4.255x-0.048 9,相關(guān)系數(shù)(R)為0.999 9。在該分析條件下,儀器信噪比為41,以3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限,可確定檢出限為25 μg/kg。結(jié)果表明,本方法的線性關(guān)系良好,檢出限能滿足食用植物油中GEs的測定要求。

      2.4 精密度和回收率

      選取葵花籽油作為基質(zhì)進行加標回收和精密度實驗,考察方法的準確度和精密度。在3個不同水平上進行加標,分別進行6次平行實驗,計算得到GEs的平均回收率和相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表4。

      表4 基質(zhì)加標回收率和精密度實驗結(jié)果(n=6)

      由表4可知,3個不同水平加標的平均回收率范圍為91.4%~97.0%,RSD小于10%,準確度和精密度良好。這說明本實驗所確定的前處理步驟和衍生化條件,適用于植物油中GEs的測定,測定結(jié)果準確、可靠,滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中檢測方法確認的技術(shù)要求,可應(yīng)用于植物油中GEs的測定。

      2.5 樣品測定

      分別選取市售的10種食用植物油產(chǎn)品,按1.2.1、1.2.3方法進行GEs含量的測定,每個樣品平行測定2次,取平均值,結(jié)果見表5。

      表5 10種食用植物油樣品中GEs的含量 mg/kg

      從表5可以看出,10個食用植物油樣品中9個樣品檢出GEs,GEs的檢出率高達90%,含量為0.073~0.873 mg/kg。歐盟EU 2018/290對植物油中GEs限量標準為1.0 mg/kg,參照歐盟限量標準可知,食用植物油中GEs的污染水平相對較高,存在一定的風(fēng)險,這可能與食用植物油的生產(chǎn)過程和工藝有關(guān),其中油脂精煉過程中的脫臭工藝是GEs產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)[11]。因此,建立準確可靠的測定方法用于監(jiān)測食用植物油中GEs含量,控制GEs的污染風(fēng)險,確保食用植物油的安全,是十分必要和緊迫的。

      3 結(jié) 論

      本文建立了同位素內(nèi)標-氣相色譜-質(zhì)譜法用于食用植物油中GEs含量的測定。采用正交實驗對衍生條件進行優(yōu)化,確定3-MBPD與PBA的最佳衍生條件為GEs質(zhì)量濃度為21.78 μg/mL時,PBA用量100 μL,衍生溫度50℃,衍生時間10 min。本方法的檢出限為25 μg/kg,平均加標回收率為91.4%~97.0%,RSD為4.4%~8.6%。方法可操作性強、重現(xiàn)性好,靈敏度、準確度和精密度均能滿足實際工作中食用植物油中GEs的定性定量檢測,可為食用植物油中GEs含量的檢測標準制定和GEs風(fēng)險監(jiān)控提供重要依據(jù)。

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