張喜峰，王鑫鑫，張青婷，羅光宏

(1.河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000； 2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000；3.河西學(xué)院 甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅 張掖 734000)

油用牡丹籽粕為油用牡丹籽榨油后的副產(chǎn)品，通常被作為肥料或動(dòng)物飼料。然而，油用牡丹籽粕含有蛋白質(zhì)、芍藥苷、丹皮酚、低聚茋類化合物等生物活性成分[1-2]，多糖作為其最重要成分之一，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的藥理活性[3-5]。因此，多糖的開發(fā)利用具有重要意義。傳統(tǒng)的水提法、酶提取法和堿提取法廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取[6-8]。水提法簡(jiǎn)單，成本低，但效率不高。酶提取法需要苛刻的操作條件，增加了生產(chǎn)成本。雖然堿提取法能提高多糖的溶出率，但部分多糖可能會(huì)發(fā)生分解。因此，開發(fā)一種綠色、高效的多糖提取方法具有重要意義。

低共熔溶劑(DES)是由氫鍵受體(HBAs)和氫鍵供體(HBDs)按照一定摩爾比形成的混合物，也被稱為離子液體(ILs)類似物。除與ILs相似的性質(zhì)外，DES還具有成本低、制備簡(jiǎn)單、生物毒性低、生物降解性好等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。因此，在萃取領(lǐng)域中，DES綠色溶劑替代了一些生物毒性高、生物降解性低的離子液體，廣泛應(yīng)用于植物資源中多種有效成分的提取，如橄欖油渣中的酚類化合物[11]、槐花中的黃酮[12]、長春花中的花青素[13]等。

雙水相體系(ATPS)作為一種液-液萃取技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。目前，已形成了不同類型的ATPS，如PEG/鹽[14]、PEG/葡聚糖[15]、有機(jī)溶劑/鹽[16]、ILs/鹽水[17]、DES/鹽水和溫敏性聚合物/鹽[18]。與其他ATPS相比，溫敏性ATPS不僅保留了ATPS的特性，還可通過改變溫度實(shí)現(xiàn)ATPS的成相組分和目標(biāo)化合物分離。環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物(EOPO)是一種溫敏性聚合物,在溫度誘導(dǎo)下可實(shí)現(xiàn)相分離。目前，基于EOPO的ATPS已廣泛應(yīng)用于苦參堿[19]、食物中痕量環(huán)丙沙星[18]和天然產(chǎn)物中生物活性成分[20]的提取。

本文以制備的16種DES為提取劑，研究DES種類、含水量、固液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，采用熱分離ATPS對(duì)油用牡丹籽粕多糖進(jìn)行初步純化，研究EOPO相對(duì)分子質(zhì)量、終質(zhì)量分?jǐn)?shù)和萃取溫度對(duì)多糖萃取效果的影響，通過溫度誘導(dǎo)相分離回收多糖和EOPO，并對(duì)多糖相對(duì)分子質(zhì)量、組成等進(jìn)行了分析測(cè)定，以期為多糖的深度開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油用牡丹籽粕，由甘肅牡丹園林工程有限公司提供，經(jīng)干燥、粉碎、過篩后備用。

芐基三正丙基氯化銨、氯化膽堿、甜菜堿、丙氨酸、尿素、乙二醇、乳酸、甘油、蘋果酸、乙酰丙酸、苯乙酸等，上海源葉生物科技有限公司；EOPO(相對(duì)分子質(zhì)量分別為2 000、2 500、2 870，分別記為EOPO2000、EOPO2500、EOPO2870)，浙江綠科安化學(xué)有限公司；光譜純溴化鉀、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸等，成都德斯特生物科技有限公司。

PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Scientific；V1100紫外可見分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；GC-MS6800氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司；GPC-IR高效凝膠滲透色譜儀，北京億路達(dá)機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DES的制備

參照文獻(xiàn)[21]方法，在80℃下，將一定摩爾比的氫鍵受體(HBAs)和氫鍵供體(HBDs)混合物加熱攪拌一定時(shí)間后獲得均勻透明的液體，即為DES。具體的HBAs與HBDs摩爾比及含水量為30%的DES黏度和pH如表1所示。

表1 DES的制備條件及產(chǎn)品指標(biāo)

續(xù)表1

1.2.2 多糖的提取

取一定量油用牡丹籽粕粉，加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇于索氏提取器，在70℃處理4 h，以除去大部分脂肪，脫脂后的殘?jiān)?0℃干燥后得到脫脂油用牡丹籽粕粉。脫脂油用牡丹籽粕粉與一定含水量的DES按一定固液比混合，超聲處理一定時(shí)間后，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)Sevag法反復(fù)多次除蛋白，得多糖粗提液。按照式(1)計(jì)算多糖得率(y1)。

(1)

式中：C為粗提液多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為粗提液的體積，mL；m為油用牡丹籽粕粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 多糖的EOPO/DES雙水相萃取

取1 mL多糖粗提液，加入一定量EOPO，充分混勻后靜置形成ATPs，其中上相為EOPO相，下相為DES相。按照式(2)計(jì)算多糖萃取率(y2)。

(2)

式中：C0和Cl分別為EOPO相和DES相多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0和Vl分別為EOPO相和DES相的體積，mL。

1.2.4 多糖的回收

取1.2.3中EOPO相，置于70℃水浴以誘導(dǎo)形成兩相，上相主要為EOPO(可重復(fù)使用)，下相為富含多糖的水相，水相減壓濃縮、冷凍干燥后即得多糖(DES-P)。按照式(3)計(jì)算多糖回收率(y3)。

(3)

式中：Ct和Cb分別為上相和下相多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；Vt和Vb分別為上相和下相的體積，mL。

1.2.5 多糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品采用苯酚硫酸法[4]測(cè)定多糖含量。

1.2.6 多糖理化特性測(cè)定

1.2.6.1 相對(duì)分子質(zhì)量

參考Li等[22]的方法，在繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上，采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對(duì)多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.2 單糖組成

參考秦春青等[23]的方法測(cè)定多糖的單糖組成。

1.2.6.3 結(jié)構(gòu)表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。多糖用KBr粉末研磨并壓入一個(gè)直徑為1 mm的小球中，在400～4 000 cm-1進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Duncan多范圍試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)中的誤差棒表示3次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 油用牡丹籽粕多糖的DES提取

2.1.1 DES種類對(duì)多糖提取效果的影響

固定固液比1∶30、DES含水量30%、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min，研究16種DES對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，16種DES中，DES8具有最佳油用牡丹籽粕多糖提取效果(p<0.05)，這可能歸因于DES8具有相對(duì)較低的黏度和弱酸性。據(jù)報(bào)道，DES物理特性如溶解度、黏度、表面張力和極性等因素是影響DES提取效果的重要因素[24]，高黏度會(huì)阻礙目標(biāo)化合物在溶液中的擴(kuò)散，傳質(zhì)效果弱[25]。此外，DES8中氫鍵供體乙二醇結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)羥基，多糖與乙二醇之間的氫鍵相互作用更強(qiáng)，可以提高多糖得率。因此，選擇DES8作為提取劑進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 DES種類對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響 mg/g

2.1.2 DES含水量對(duì)多糖提取效果的影響

固定固液比1∶30、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min，研究DES含水量對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 DES含水量對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖1可知，隨著DES含水量由10%增加至50%，多糖得率呈逐漸增加趨勢(shì)(p<0.05)，當(dāng)DES含水量繼續(xù)增加時(shí)，多糖得率逐漸下降?？赡苁且?yàn)檫m量水的加入可降低DES的黏度，提高傳質(zhì)效果，但含水量過大時(shí)會(huì)破壞HBAs、HBDs和多糖之間的氫鍵相互作用，導(dǎo)致DES的提取能力下降。因此，確定DES含水量為50%。

2.1.3 固液比對(duì)多糖提取效果的影響

固定DES含水量50%、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min，研究固液比對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 固液比對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖2可知，在固液比1∶10～1∶30的范圍內(nèi)，多糖得率隨固液比的增加而增加(p<0.05)，繼續(xù)增加固液比時(shí)，多糖得率變化不顯著(p>0.05)?？赡苁且?yàn)楣桃罕容^小時(shí)，會(huì)導(dǎo)致提取量不足，固液比過大會(huì)導(dǎo)致浪費(fèi)，甚至不利于提取。因此，確定固液比為1∶30。

2.1.4 提取溫度對(duì)多糖提取效果的影響

固定DES含水量50%、固液比1∶30、提取時(shí)間40 min，研究提取溫度對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖3可知，多糖得率隨著提取溫度的升高而增加，當(dāng)提取溫度超過50℃后，多糖得率呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)檩^高的溫度可以加速分子的擴(kuò)散，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更易被破壞，促進(jìn)多糖溶出，而過高的溫度可能引起熱敏性物質(zhì)分解，影響其得率。因此，確定提取溫度為50℃。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響

固定DES含水量50%、固液比1∶30、提取溫度50℃，研究提取時(shí)間對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)油用牡丹籽粕多糖提取效果的影響

由圖4可知，多糖得率在20～40 min范圍內(nèi)隨提取時(shí)間延長逐漸增加(p<0.05)，而后隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長而降低。此現(xiàn)象歸因于多糖在一定時(shí)間內(nèi)溶出率提高，但過長的提取時(shí)間可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，降低其得率。因此，確定40 min為最佳的提取時(shí)間。

在以DES8為提取劑、DES含水量50%、固液比1∶30、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min下按1.2.2進(jìn)行多糖提取，測(cè)得多糖得率為96.58 mg/g。

2.2 EOPO/DES雙水相萃取多糖

2.2.1 EOPO相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)多糖萃取效果的影響

取1 mL多糖粗提液，加入EOPO使其在溶液中終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，在萃取溫度為45℃條件下，研究EOPO相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)多糖萃取效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 EOPO相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)多糖萃取效果的影響

EOPO相對(duì)分子質(zhì)量不同，其黏性也不同，從而影響雙水相體系成相能力。由圖5可知，在雙水相體系中，相對(duì)分子質(zhì)量為2 500的EOPO形成的雙水相體系多糖萃取率最高，且與其他兩種相對(duì)分子質(zhì)量的EOPO相比，具有顯著差異(p<0.05)，這歸因于EOPO的鏈長、極性和黏度共同影響雙水相萃取效果。因此，確定采用EOPO2500進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖萃取效果的影響

取1 mL多糖粗提液，加入不同量的EOPO2500使其形成不同終質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在萃取溫度為45℃條件下，研究EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖萃取效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖萃取效果的影響

由圖6可知，多糖萃取率隨著EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加而增加，當(dāng)EOPO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，多糖萃取率達(dá)到最大?？赡苁且?yàn)檩^高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EOPO增加了多糖與EOPO間的接觸面積，促進(jìn)多糖優(yōu)先分配在EOPO相。隨著EOPO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，多糖萃取率略有下降，可能是由于高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下共聚物的熵效應(yīng)和體積排阻效應(yīng)的結(jié)果。另外，過高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)導(dǎo)致其黏度較大，不利于多糖富集在EOPO相。因此，確定EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%。

2.2.3 萃取溫度對(duì)多糖萃取效果的影響

取1 mL多糖粗提液，加入EOPO2500使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，研究萃取溫度對(duì)多糖萃取效果的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 萃取溫度對(duì)多糖萃取效果的影響

由圖7可知，隨萃取溫度升高多糖萃取率增大，當(dāng)萃取溫度超過45℃時(shí)，多糖萃取率呈下降趨勢(shì)。適當(dāng)升高溫度可以降低黏度，加速目標(biāo)化合物在兩相間的分布。但隨著萃取溫度不斷升高，EOPO相飽和度增加，多糖的自由空間減小，降低了多糖萃取率。同時(shí)，EOPO是一種溫度敏感性的聚合物，其濁點(diǎn)約在70℃[26]。當(dāng)萃取溫度持續(xù)接近濁點(diǎn)時(shí)，EOPO與多糖分離，阻礙多糖進(jìn)入EOPO相。因此，確定萃取溫度為45℃。

在EOPO/DES體系中，當(dāng)EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%、萃取溫度為45℃時(shí)，多糖萃取率最高，為89.56%。

2.3 多糖的回收率

按1.2.4回收多糖，測(cè)得多糖回收率為86.15%。

2.4 多糖化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)測(cè)定，DES-P的純度為76.59%，蛋白質(zhì)含量為1.29%。結(jié)果表明，采用DES雙水相提取油用牡丹籽粕多糖是一種有效的提取方法。

由HPGPC測(cè)定的DES-P的相對(duì)分子質(zhì)量分布如圖8所示。由圖8可知，DES-P由兩個(gè)對(duì)稱的峰組成，表明二者屬于不同種類。由校正曲線建立的回歸方程為logMw=-0.341 1X+9.894 2(Mw為平均相對(duì)分子質(zhì)量，X為洗脫時(shí)間)，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.992 9。根據(jù)該方程計(jì)算DES-P的兩個(gè)對(duì)稱峰平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為67.76 kDa(88.26%)和2.26 kDa(11.74%)。

圖8 DES-P相對(duì)分子質(zhì)量分布

DES-P的總離子流圖如圖9所示，通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比較，確定DES-P主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，其摩爾比為1∶2.5∶0.78。

圖9 DES-P的總離子流圖

DES-P的紅外光譜譜圖如圖10所示。由圖10可知：在3 424、2 921 cm-1處的強(qiáng)吸收峰歸因于O—H和C—H的拉伸振動(dòng)；1 643、1 414 cm-1左右吸收峰歸因于羧基和羰基的存在；1 000～1 200 cm-1吸收峰表明DES-P存在C—O—C和C—O—H；855 cm-1左右吸收峰歸因于多糖中β-糖苷鍵。

圖10 DES-P紅外光譜圖

3 結(jié) 論

在本研究中，構(gòu)建了一種基于溫度敏感性低共熔溶劑雙水相萃取分離油用牡丹籽粕多糖的方法，采用DES(氯化膽堿-乙二醇)作為最佳提取劑，當(dāng)其含水量50%，固液比1∶30、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min時(shí)，多糖得率為96.58 mg/g。隨后，采用EOPO/DES雙水相萃取分離多糖，當(dāng)EOPO2500終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%、萃取溫度為45℃時(shí)，多糖在EOPO相萃取率為89.56%；將EOPO相在70℃水浴進(jìn)行溫度誘導(dǎo)分相，實(shí)現(xiàn)了多糖的回收，回收率為86.15%；所制備的多糖(DES-P)的平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為67.76 kDa(88.26%)和2.26 kDa(11.74%)，由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，三者摩爾比為1∶2.5∶0.78。溫敏性低共熔溶劑雙水相體系A(chǔ)TPS具有環(huán)境友好、萃取能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、效率高、組分便于回收等特性，可作為多糖萃取分離的有效方法。