（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城 252059）

蜂膠是由蜜蜂采集樹脂并混入蜂蠟、花粉及自身腺體分泌物所得到的一種天然產(chǎn)物[1]，蜂膠的化學(xué)成分具有高度的復(fù)雜性和可變性[2]。迄今為止從蜂膠中鑒定出的化學(xué)組分高達(dá) 20多類、600多種，主要有黃酮類、酚酸類、萜烯酸、類固醇類、氨基酸類等[3]。由于蜂膠復(fù)雜的化學(xué)組分，使得蜂膠具備豐富而獨(dú)特的生物活性，如抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等功效[4-8]。目前蜂膠廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品等行業(yè)，但其功效成分和作用機(jī)理還未完全闡明。

我們前期研究了蜂膠中分離純化出的11種化學(xué)成分（咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素）的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)蜂膠中酚酸類物質(zhì)的抗腫瘤功效較弱，黃酮及其酯類具有較好的抗腫瘤活性[9,10]；但蜂膠中這些抗腫瘤功效成分之間相互作用目前還缺乏研究。此外，前期通過不同濃度（40%～90%）的甲醇-水洗脫，我們從蜂膠乙酸乙酯提取物中分離出8段組分（Ⅰ-Ⅷ），并研究了這8段組分的抗炎功效，發(fā)現(xiàn)這8段組分對蜂膠的抗炎功效均有作用[11,12]。但這8段組分的抗腫瘤功效與抗炎功效是否相同，目前還不清楚。基于此，本研究通過8種不同腫瘤細(xì)胞，詳細(xì)研究了不同濃度甲醇-水（40%～90%）洗脫的蜂膠中8段組分（Ⅰ-Ⅷ）的抗腫瘤功效，為蜂膠的抗腫瘤活性應(yīng)用及質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肺癌細(xì)胞（A549和H1299）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7和MDA-MB-231）、食管癌細(xì)胞（Eca109和TE-11）、膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87）和宮頸癌細(xì)胞（HeLa）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

中國蜂膠產(chǎn)自山東省，膠源植物主要為楊屬植物；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）（sigma）；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板（Fisher公司）；Tris（上海生工）；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

HFsafe1200超凈工作臺、MCO-17A CO2培養(yǎng)箱（上海力康科學(xué)儀器有限公司）；TE2000S 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；AR2140電子分析天平（美國奧豪斯公司）；優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蜂膠脂溶性部位主要成分的制備、分離和鑒定

蜂膠水提物的殘?jiān)?jīng)乙酸乙酯浸提，然后經(jīng)40%～90%濃度的甲醇-水洗脫，得到8段組分（Ⅰ-Ⅷ），具體步驟見參考文獻(xiàn)[12]。其中，分離得到的8段組分，通過HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析檢測，主要成分見參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

A549、H1299、MCF-7、MDA-MB-231、Eca109、TE-11、U87和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基或PRIM-1640培養(yǎng)基中。孵育條件為：5% CO2、37°C、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 細(xì)胞存活率的測定

將處于對數(shù)生長期的8種不同腫瘤細(xì)胞按4000個/孔種植到96孔板中，37℃、5% CO2孵育，待細(xì)胞長到60%以上，分別經(jīng)25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的Ⅰ-Ⅷ 8段組分處理24h和48h。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，水洗，晾干；然后用SRB染色10min，水洗，晾干；最后用100mM Tris堿溶解已著色的細(xì)胞，在492nm處測吸光值。

細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蜂膠中8段組分對肺癌A549和H1299細(xì)胞存活率的影響

肺癌是嚴(yán)重威脅人體健康的第一大惡性腫瘤。首先我們檢測了蜂膠中8段組分（25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml）對兩種肺癌細(xì)胞A549和H1299的存活率的影響。由圖1可以看出，Ⅰ-Ⅷ 8段組分對A549和H1299細(xì)胞存活率的影響不同。在24h，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段組分對A549細(xì)胞增殖抑制功效顯著；而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對H1299細(xì)胞抑制效果顯著；在48h，隨著作用時(shí)間的延長，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段組分對A549細(xì)胞的抑制功效較24h顯著，且呈劑量依賴性。同樣，在48h，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對H1299細(xì)胞增殖的抑制功效隨時(shí)間和濃度的增加效果也顯著增強(qiáng)，而且Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段對H1299的抑制功效比對A549細(xì)胞的抑制功效更顯著。

圖1 蜂膠中8段組分對肺癌A549和H1299細(xì)胞存活率的影響

2.2 蜂膠中8 段組分對乳腺癌MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞存活率的影響

MCF-7是雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞，而MDA-MB-231細(xì)胞是三陰性乳腺癌細(xì)胞，具有更高的浸潤和轉(zhuǎn)移特征，預(yù)后效果較差。接著，我們檢測了蜂膠中8段組分（25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml）對兩種乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231存活率的影響。由圖2可以看出，蜂膠中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制效果具有時(shí)間和劑量的依賴性，而且在48h，蜂膠中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制效果較MCF-7更顯著。

圖2 蜂膠中8段組分對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

2.3 蜂膠中8段組分對食管癌Eca109和TE-11細(xì)胞存活率的影響

食管癌是一種消化道惡性腫瘤，我國是食管癌的高發(fā)區(qū)。我們檢測了蜂膠中8段組分分別對兩種食管癌細(xì)胞Eca109和TE-11存活率的影響。如蜂膠中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制兩種乳腺癌細(xì)胞一樣，蜂膠中這四段組分抑制Eca109和TE-11細(xì)胞增殖也是呈時(shí)間和劑量依賴的，而且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對TE-11細(xì)胞的抑制功效較Eca109細(xì)胞更強(qiáng)。

圖3 蜂膠中8段組分對食管癌Eca109和TE-11細(xì)胞存活率的影響

2.4 蜂膠中8段組分對膠質(zhì)瘤U87和宮頸癌HeLa細(xì)胞存活率的影響

由圖4A可以看出，蜂膠中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖隨時(shí)間和劑量的增加，抑制效果也越顯著。在24h時(shí)，蜂膠中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對HeLa細(xì)胞的抑制功效較其他段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）顯著；在48h，除蜂膠中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制HeLa細(xì)胞增殖外，蜂膠中Ⅱ段也顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖。

圖4 蜂膠中8段組分對U87和HeLa細(xì)胞存活率的影響

3 討論

蜂膠的化學(xué)成分十分復(fù)雜，目前蜂膠應(yīng)用中最大的難題就是藥效不穩(wěn)定，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。本實(shí)驗(yàn)通過8種不同的腫瘤細(xì)胞研究了蜂膠乙酸乙酯提取物經(jīng)40%～90%甲醇-水洗脫后得到的8段化合物的抗腫瘤功效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對8種不同的腫瘤細(xì)胞均有抑制功效，Ⅱ和Ⅵ對某些腫瘤細(xì)胞也具有一定的抑制功效。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段甲醇-水的洗脫濃度在60%～75%之間，說明在這個濃度范圍內(nèi)，蜂膠乙酸乙酯提取物中的主要抗腫瘤功效成分被洗脫出來。盡管Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段甲醇-水的洗脫濃度較高，但是由于蜂膠中主要抗腫瘤功效成分已經(jīng)在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脫出來，所以Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段對8種腫瘤細(xì)胞的抑制功效不顯著；同樣Ⅰ、Ⅱ段甲醇-水濃度較低，蜂膠中主要抗腫瘤功效組分洗脫下來的比較少，其抗腫瘤功效也較弱。這說明，首先甲醇-水的濃度決定了蜂膠乙酸乙酯提取物中抗腫瘤功效成分能否被洗脫下來；其次，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脫的甲醇-水濃度不同，其化學(xué)組分盡管不完全相同，但其對8種不同的腫瘤細(xì)胞均具有抑制功效，說明蜂膠抗腫瘤的功效成分是多種化合物共同作用的結(jié)果，而且主要是黃酮類化合物和酯類的種類和含量決定的，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脫成分中，黃酮類化合物和酯類物質(zhì)種類多，含量高；再次，通過Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段化學(xué)成分分析可以看出，盡管Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段中可能某一蜂膠抗腫瘤功效成分如白楊素含量較高，但其他抗腫瘤功效組分含量較少，導(dǎo)致Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段抗腫瘤功效也不顯著，說明蜂膠的抗腫瘤功效是由蜂膠中抗腫瘤功效成分的種類和含量決定的，兩者缺一不可。

前期我們首先在蜂膠中分離出11種單體，測定了每一種單體的抗腫瘤功效，確定在蜂膠中發(fā)揮抗腫瘤活性的主要是黃酮類和酯類[10]。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的甲醇-水洗脫出8段不同的組分，進(jìn)一步確定了蜂膠抗腫瘤功效成分之間的相互作用和決定蜂膠抗腫瘤功效的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)研究為蜂膠的質(zhì)量評價(jià)體系提供了一定的參考價(jià)值。