秦晉鈺，宋月荷，蔡翠芳

(山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031)

顯微鑒別法作為一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的手段[1-3]，以操作簡單、耗時(shí)短、成本低、直觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而備受歡迎[4]。顯微鑒別法樣品中以粉末和橫切面兩種形態(tài)最常用[5-10]，其中橫切面更能全面直觀的反映藥材的細(xì)胞形狀、組織構(gòu)造及內(nèi)含物等特征，這些特征在一定程度上與柴胡的好壞優(yōu)劣有聯(lián)系，而粉末顯微差異并不明顯[11]。邢普[12]等運(yùn)用顯微鑒別法清晰的展示了柴胡根、莖、葉、果實(shí)的組織橫切面顯微特征結(jié)構(gòu)，為柴胡正本清源提供了鑒別依據(jù)。顯微制片有多種方法[13]，其中以操作簡單的徒手切片法最為常用[14-15]，這兩種方式均需要用一定的試劑進(jìn)行浸泡前處理，使其軟化。實(shí)際生產(chǎn)中多采用水浸法處理[16-18]，這種方法在實(shí)際操作中存在著膨脹快、結(jié)構(gòu)易損壞等缺點(diǎn)，影響觀察。因此，本文欲探究一種相對(duì)優(yōu)化的試劑進(jìn)行浸泡前處理，使得錐葉柴胡和耳葉黑柴胡組織特征結(jié)構(gòu)能夠保持原狀，提高切片成功率，以利于顯微觀察。

1 材料與儀器

1.1 材 料

試驗(yàn)用錐葉柴胡和耳葉黑柴胡為傘形科植物柴胡的野生品，產(chǎn)地為山西；水合氯醛、間苯三酚、濃鹽酸、甘油、乙醇，以上試劑均來自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀 器

試驗(yàn)使用Panthera顯微鏡，購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

2 方 法

參照《中國藥典》(2015年版)規(guī)定的顯微鑒定方法[19]，將錐葉柴胡的根分別用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、水合氯醛、水合氯醛:稀甘油為1:1、水合氯醛:稀甘油為2:1、水合氯醛:稀甘油為3:1、水合氯醛:稀甘油為4:1、水合氯醛:稀甘油為5:1等10種不同的試劑進(jìn)行相同時(shí)間的浸泡處理，將耳葉黑柴胡的根分別用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水合氯醛:稀甘油為3:1等5種試劑進(jìn)行同樣條件的浸泡處理，將耳葉黑柴胡的葉分別用水和水合氯醛:稀甘油為3:1的2種試劑進(jìn)行同樣條件的浸泡處理，進(jìn)而制作徒手切片，置于顯微鏡下觀察研究不同試劑處理時(shí)其橫切面的組織特征。

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)錐葉柴胡根顯微特征的影響

柴胡根由周皮和維管束組成，位于外方的是周皮，內(nèi)方呈環(huán)狀排列的是無限外韌型維管束。周皮由木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層3部分組成；維管束由韌皮部和木質(zhì)部組成，見圖1、圖2。

圖1 錐葉柴胡根顯微特征圖(10×4)

圖2 耳葉黑柴胡根顯微特征圖(10×4)

3.1.1 用水和不同濃度乙醇進(jìn)行浸泡處理

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用水浸泡處理后，可觀察到錐葉柴胡根中木質(zhì)部木射線細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞被拉長，細(xì)胞間界限不分明；韌皮部油管分泌細(xì)胞變形，見圖3，分析是由于細(xì)胞吸水膨脹，進(jìn)而體積發(fā)生變化導(dǎo)致的。

圖3 用水浸泡的錐葉柴胡顯微特征圖(10×40)

用不同濃度的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇分別浸泡處理后，可觀察到錐葉柴胡根中木質(zhì)部木射線細(xì)胞存在不同程度的破裂，內(nèi)含物外溢，見圖4；形成層界限不清晰，見圖5；韌皮部細(xì)胞破裂，油管界限不分明，油管細(xì)胞破裂，見圖6，分析以上現(xiàn)象是由于乙醇為水溶性的有機(jī)溶劑，浸泡過程中使得細(xì)胞吸收溶液而膨脹變形，甚至發(fā)生破裂。

圖4 用不同濃度乙醇浸泡的錐葉柴胡木質(zhì)部顯微特征圖(10×40)

圖5 用不同濃度乙醇浸泡的錐葉柴胡形成層顯微特征圖(10×40)

圖6 用不同濃度乙醇浸泡的錐葉柴胡韌皮部顯微特征圖(10×40)

3.1.2 用水合氯醛和稀甘油以不同配比進(jìn)行浸泡處理

用水合氯醛浸泡處理后，可觀察到錐葉柴胡根中木質(zhì)部射線細(xì)胞破裂，形成管道；韌皮部細(xì)胞有破裂跡象，見圖7。

圖7 用水合氯醛浸泡的錐葉柴胡顯微特征圖(10×40)

用水合氯醛：稀甘油配比分別為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的溶液浸泡處理后，可觀察到水合氯醛：稀甘油配比分別為1:1和2:1時(shí)，錐葉柴胡根木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞基本保持完好，偶有破裂，細(xì)胞界限仍不分明(圖8、圖9)。當(dāng)水合氯醛:稀甘油配比為3:1時(shí)，可觀察到錐葉柴胡根中木質(zhì)部木射線細(xì)胞完整，界限清晰分明；形成層界限清晰；韌皮部細(xì)胞完整，界限清晰，油管清晰，見圖10。隨著水合氯醛:稀甘油配比增加到4:1和5:1時(shí)，可觀察到錐葉柴胡根中木質(zhì)部、形成層、韌皮部的細(xì)胞基本完整，界限清晰，油管清晰(圖11)。

圖8 用水合氯醛:稀甘油為1:1浸泡的錐葉柴胡顯微特征圖(10×40)

圖11 用水合氯醛:稀甘油為5:1浸泡的錐葉柴胡顯微特征圖(10×40)

3.2 對(duì)耳葉黑柴胡根顯微特征的影響

3.2.1 用水和不同濃度乙醇進(jìn)行浸泡處理

用水浸泡處理后，可觀察到耳葉黑柴胡根中木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞均存在膨脹變形，部分細(xì)胞發(fā)生破裂的現(xiàn)象(圖12)。

圖12 用水浸泡的耳葉黑柴胡顯微特征圖(10×40)

用不同濃度的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇分別浸泡處理后，可觀察到耳葉黑柴胡根中木質(zhì)部細(xì)胞存在大面積破裂，細(xì)胞界限模糊(圖13)；韌皮部細(xì)胞界限不分明，油管細(xì)胞破裂(圖14)。

圖13 用不同濃度乙醇浸泡的耳葉黑柴胡木質(zhì)部顯微特征圖

圖14 用不同濃度乙醇浸泡的耳葉黑柴胡韌皮部顯微特征圖(10×40)

3.2.2 用水合氯醛和稀甘油配比為3:1進(jìn)行浸泡處理

用在錐葉柴胡中優(yōu)選出的水合氯醛：稀甘油配比為3:1的溶液對(duì)耳葉黑柴胡進(jìn)行浸泡處理，可觀察到耳葉黑柴胡根中木質(zhì)部木射線細(xì)胞基本保持完好，細(xì)胞界限清晰；形成層界限分明；韌皮部細(xì)胞完整，界限清晰，油管清晰，見圖15。

圖15 用水合氯醛:稀甘油為3:1浸泡的耳葉黑柴胡顯微特征圖(10×40)

3.3 對(duì)耳葉黑柴胡葉顯微特征的影響

葉的橫切面一般由表皮、葉肉、葉脈3部分組成，見圖16。

圖16 耳葉黑柴胡葉顯微特征圖(10×10)

分別用傳統(tǒng)水浸法和上述優(yōu)選出的水合氯醛:稀甘油為3:1的溶液對(duì)耳葉黑柴胡葉進(jìn)行浸泡處理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于水浸泡處理，用水合氯醛:稀甘油為3:1浸泡處理的耳葉黑柴胡葉，柵欄組織和海綿組織細(xì)胞排列更緊密且完好，細(xì)胞間隙更清晰，見圖17、圖18。

圖17 用水合氯醛:稀甘油為3:1浸泡的耳葉黑柴胡葉顯微特征圖(10×40)

圖18 用水浸泡的耳葉黑柴胡葉顯微特征圖(10×40)

4 結(jié) 論

本文中，將水、乙醇、水合氯醛及水合氯醛與稀甘油的混合液分別作為顯微制片前處理中的浸泡試劑，研究發(fā)現(xiàn)：

(1)不同濃度的乙醇溶液其顯微組織形態(tài)比水破壞的更嚴(yán)重，這可能與同等條件下乙醇具有更強(qiáng)的揮發(fā)性有關(guān)；

(2)隨著水合氯醛與稀甘油配比的增加，當(dāng)比例為3:1、4:1及5:1時(shí)，顯微組織特征保持完整，分析認(rèn)為是由于在顯微制片中常用作透化劑的水合氯醛[20]，具有能迅速滲入組織細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)溶解脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉粒等細(xì)胞后含物等特性，便于顯微鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)，和稀甘油組成混合液會(huì)使得浸泡處理和徒手切片間隙不易干裂；

(3)同一試劑浸泡后不同部位顯微組織形態(tài)破壞情況不一，分析認(rèn)為是由于木質(zhì)部、韌皮部等不同部位的細(xì)胞吸收膨脹速度不一致。

綜上所述，考慮到同等條件下以節(jié)省原料為原則，以及水合氯醛對(duì)人體的傷害和其在低溫下質(zhì)地黏稠不利于浸泡處理等情況，優(yōu)選水合氯醛：稀甘油比例為3:1的溶液作為浸泡處理試劑，該試劑對(duì)錐葉柴胡的根及耳葉黑柴胡的根和葉均適用。值得探究的是浸泡時(shí)間長短對(duì)顯微組織特征的影響，浸泡時(shí)間短，切片硬，容易碎；浸泡時(shí)間長，切片軟，操作難度大，片型很難均勻；試驗(yàn)所用的柴胡品種及產(chǎn)地有限，此浸泡處理試劑對(duì)不同種類柴胡的普適性有待考證。