仔豬腸道免疫與腸道健康

韓若嬋，左玉柱,賽力克·巴合達(dá)吾列提，梁 琳，崔尚金

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京，100193；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 楊陵，712100；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；4.新疆阿勒泰地區(qū)動物疾病控制與診斷中心 新疆 阿勒泰，836500)

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是動物全身最大的淋巴器官，主要指腸道相關(guān)淋巴樣組織(gut-associated lymphoid tissue, GALT)。腸道相關(guān)淋巴組織主要包括派氏集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches, PP)和腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes, MLN)，二者共同激活腸道的免疫反應(yīng)[1]。腸道淋巴細(xì)胞包括固有層中的淋巴細(xì)胞(PL)和腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)，是免疫反應(yīng)的效應(yīng)部位[2]。腸道免疫系統(tǒng)通過體液免疫和細(xì)胞免疫共同作用，阻止內(nèi)毒素和有害微生物入侵腸道，清除機(jī)體識別的抗原物質(zhì)，從而維持正常的腸道屏障功能。派氏集合淋巴結(jié)是T細(xì)胞分化和增殖的第一場所，通過和其他免疫細(xì)胞的相互作用，誘導(dǎo)免疫耐受，抵抗病原菌的感染。腸系膜淋巴結(jié)是一群位于腸系膜內(nèi)的大淋巴結(jié)，腸道內(nèi)抗原對MLN的發(fā)育至關(guān)重要，如斷乳前后，腸內(nèi)抗原迅速增多，導(dǎo)致MLN迅速發(fā)育。固有層是發(fā)生腸道免疫應(yīng)答的效應(yīng)部位，含有豐富的免疫細(xì)胞，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等，這些免疫細(xì)胞是維持腸道穩(wěn)態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)者。腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以CD8+T細(xì)胞為主，與傳統(tǒng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞不同，IEL細(xì)胞具有調(diào)節(jié)腸道平衡、維持上皮細(xì)胞屏障功能及調(diào)節(jié)獲得性和天然免疫應(yīng)答等功能的特點。

1 仔豬腸道黏膜免疫系統(tǒng)特點

成年豬的派氏集合淋巴結(jié)、小腸絨毛外部和小窩具有高度分化的免疫組織結(jié)構(gòu)。派氏集合淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)最先接觸進(jìn)入體內(nèi)的抗原，增殖分化生成相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，進(jìn)入到腸道的片層結(jié)構(gòu)中，發(fā)揮其免疫效應(yīng)功能。腸道黏膜上也存在大量的免疫細(xì)胞，并具有相應(yīng)的免疫功能。其中，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞分布在黏膜上皮內(nèi)和上皮下層中，CD4+輔助性T細(xì)胞分布在固有片層中。基質(zhì)細(xì)胞（主要的上皮細(xì)胞）和樹突狀細(xì)胞表面還表達(dá)大量的組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ類分子（T細(xì)胞識別的抗原）。人類和嚙齒動物MHC-Ⅱ類分子主要表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上，但豬腸道小窩內(nèi)T細(xì)胞的表達(dá)量卻很高。

剛出生的仔豬，除了沒有內(nèi)在的循環(huán)抗體外，其黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育也不完全，在出生后的一段時間內(nèi)才能建立起來。此過程可分為四個階段。新生階段：仔豬的小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞較少，黏膜淋巴細(xì)胞開始聚集并形成派氏集合淋巴結(jié)，但與成年動物的T細(xì)胞聚集區(qū)域相比，此時仔豬的淋巴集結(jié)還沒有形成明顯的免疫組織結(jié)構(gòu)。出生后第2周：小腸內(nèi)淋巴細(xì)胞快速集結(jié)，這些細(xì)胞表面存在CD2+，但還沒有CD4和CD8。派氏集合淋巴結(jié)在此階段開始形成正常的組織結(jié)構(gòu)。2～4周齡的仔豬：小腸黏膜上CD4+T細(xì)胞開始聚集，但仍缺乏CD8+細(xì)胞，開始出現(xiàn)少量B細(xì)胞，并開始分泌IgM。5周后：小腸上皮內(nèi)出現(xiàn)CD8+細(xì)胞，在腸道小窩內(nèi)可分泌IgA的B細(xì)胞也開始出現(xiàn)。7周后小腸的各種結(jié)構(gòu)基本達(dá)到成年動物的水平[3]。

腸道內(nèi)出現(xiàn)的細(xì)菌對黏膜免疫的建立起著重要作用。悉生動物出生后體內(nèi)很快出現(xiàn)CD2+細(xì)胞，但生長后期CD4+、CD8+細(xì)胞卻沒有出現(xiàn)，并且派氏集合淋巴結(jié)的大小比普通動物和SPF動物小，分泌IgM的B細(xì)胞也多于分泌IgA的B細(xì)胞。說明腸道內(nèi)B淋巴細(xì)胞的增生需要某些微生物的刺激，并且細(xì)菌對黏膜免疫的影響大于對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，對分泌IgM和IgA的影響也存在這種差異。

腸道細(xì)菌促進(jìn)黏膜免疫系統(tǒng)建立的途徑有兩種：第一，免疫效應(yīng)細(xì)胞因細(xì)菌的（也可以不是真正的致病原）刺激而大量聚集，這是一個獨立的控制機(jī)制。第二，細(xì)菌促進(jìn)黏膜免疫系統(tǒng)逐漸建立起一個效應(yīng)與調(diào)節(jié)平衡的機(jī)制。機(jī)制的建立需要經(jīng)歷一個特定的發(fā)展階段，不同亞型的T細(xì)胞相繼出現(xiàn)以維持效應(yīng)與調(diào)節(jié)功能之間的平衡[4]。仔豬出生后自身黏膜免疫系統(tǒng)通過效應(yīng)與調(diào)節(jié)功能的發(fā)展，在一定范圍內(nèi)保持平衡；一旦平衡被破壞，就會造成黏膜損傷。通過此平衡模式，可以預(yù)測新生仔豬免疫功能所受到的各種影響。

此外，腸道黏膜免疫系統(tǒng)也受環(huán)境因素的控制。腸道黏膜內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞都依靠其自身的微生物環(huán)境而存活，比普通免疫細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。在派氏集合淋巴結(jié)和腸道黏膜內(nèi)，效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相互協(xié)調(diào)作用，能夠準(zhǔn)確識別環(huán)境中出現(xiàn)的每一種抗原，做出正確的反應(yīng)。在腸道黏膜中存在大量T細(xì)胞時，意味著機(jī)體的免疫正在對無害的食物抗原和有益的共生細(xì)菌產(chǎn)生免疫耐受，而不是發(fā)動免疫反應(yīng)。

2 黏膜耐受和主動免疫反應(yīng)

腸道黏膜耐受對新生仔豬的健康非常重要。腸道相關(guān)淋巴樣組織在仔豬出生和斷乳后會持續(xù)接觸食物中各種抗原成分和通過腸道途徑進(jìn)入的各種微生物，并能有效區(qū)分病原菌和食物抗原成分，一方面對侵入的病原菌做出及時有效的免疫應(yīng)答，另一方面又能避免對共生菌和食物蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。衡量腸道的健康標(biāo)準(zhǔn)，就是看腸道是否具有快速有效區(qū)分有害和無害物質(zhì)的能力，和能否準(zhǔn)確做出相應(yīng)反應(yīng)的能力。

口服耐受是機(jī)體免疫系統(tǒng)對口服抗原產(chǎn)生的特異性無應(yīng)答或低應(yīng)答狀態(tài)。如3周齡仔豬在斷乳后第2天飼喂以大豆為基礎(chǔ)的飼料，可在血清中檢測到大豆蛋白β-conglycinin，如果血液中吸收的蛋白達(dá)到一定濃度（80 ng/mL），就會刺激仔豬快速產(chǎn)生針對大豆蛋白的抗體IgG。這種反應(yīng)與同日齡仔豬注射含有佐劑大豆蛋白產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相同，但兩個反應(yīng)明顯受控于兩個不同的免疫機(jī)制。如果新生仔豬曾經(jīng)接觸過大豆蛋白，再次飼喂時免疫反應(yīng)就會受到抑制，但不會影響到通過注射產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。對于正常的食物蛋白，腸道黏膜免疫系統(tǒng)主要通過由抗原特異性T細(xì)胞克隆無能或缺失（clonal anergy or deletion）和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的主動抑制等機(jī)制誘導(dǎo)口服耐受，來防止對食物蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)?？诜乖芗せ罡鞣N類型的調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞，在腸道免疫系統(tǒng)中，與其他輔助性T細(xì)胞相比，Treg細(xì)胞的分化呈優(yōu)勢狀態(tài)，其分布廣泛，在腸道黏膜和淋巴結(jié)中均大量存在。Treg細(xì)胞主要通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的功能，在維持腸道免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Treg細(xì)胞產(chǎn)生的抑制性細(xì)胞因子主要包括IL-10、TGF-β和IL-35[5]，這些細(xì)胞因子可抑制效應(yīng)T 細(xì)胞功能的發(fā)揮，從而導(dǎo)致免疫耐受的形成。此外，腸道樹突狀（DC）細(xì)胞在維持口服耐受中發(fā)揮重要作用。口服耐受是一個復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，涉及到多種細(xì)胞和分子機(jī)制。除DC和Treg細(xì)胞外，還有其他細(xì)胞參與口服耐受的形成。因此對口服耐受的機(jī)制研究仍是今后的研究熱點。

不但口服蛋白可以引起免疫耐受，腸道共生細(xì)菌所產(chǎn)生的某些物質(zhì)也可以引起免疫耐受，一旦破壞這種耐受則會導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。腸道共生菌的主要功能是維持腸道免疫系統(tǒng)的平衡，調(diào)節(jié)宿主代謝，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)更好地被利用，并幫助宿主機(jī)體抵御外來微生物的入侵。GALT對共生菌的耐受主要是由共生菌自身的特點、小腸上皮細(xì)胞的特性及腸道黏膜固有層內(nèi)免疫細(xì)胞的特點3個方面的因素所決定。第一，共生菌與致病菌不同，不能表達(dá)黏附、侵入因子及黏蛋白酶，共生菌定居腸道的能力較弱。第二，小腸上皮細(xì)胞的模式識別受體不能直接和共生菌接觸，如表達(dá)在上皮細(xì)胞基底外側(cè)的TLR5與上皮細(xì)胞頂側(cè)的共生菌無法直接接觸，因此不能有效地識別共生菌的PAMP。TLR能識別病原菌，并介導(dǎo)NF-κB的活化，引起腸道炎癥反應(yīng)，而共生菌能通過活細(xì)胞核受體過氧化物酶體增殖子活化受體γ （peroxisome-proliferator-activate receptor-γ, PPAR-γ）抑 制NF-κB的活性。第三，從腸道黏膜固有層的特點來看，固有層內(nèi)含有特殊的耐受性DC、Treg和巨噬細(xì)胞，無法引起對共生菌的炎癥反應(yīng)，其識別病原菌主要是通過TLR5和細(xì)胞因子的分泌[6]。這些免疫細(xì)胞可以產(chǎn)生許多抗炎癥的細(xì)胞因子（如IL-10和TGF-β）抑制共生菌的固有炎癥反應(yīng)，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[7]。此外，共生菌可以促進(jìn)腸系膜淋巴結(jié)和派氏集合淋巴結(jié)中的CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的增殖，使機(jī)體對共生菌產(chǎn)生免疫耐受。腸道黏膜免疫系統(tǒng)對共生菌的耐受性對維持腸道免疫平衡至關(guān)重要。

3 斷乳對仔豬免疫系統(tǒng)的影響

母乳是仔豬斷乳前營養(yǎng)、抗體和其他生理活性物質(zhì)的唯一或最基本的外部來源，除了為仔豬的發(fā)育提供能量、蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等基本營養(yǎng)外，還提供一些有益的活性物質(zhì)。此外，初乳和常乳中的乳源生長因子、激素及其他活性物質(zhì)對出生后仔豬胃腸道的分化和發(fā)育具有重要作用，斷乳會對仔豬的腸道和黏膜免疫系統(tǒng)造成很大影響。在斷乳后24 h內(nèi)仔豬小腸絨毛會變短，4～5 d后嚴(yán)重影響到腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。這個階段，腸道內(nèi)CD2+淋巴細(xì)胞明顯增多，腸道小窩內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在斷乳前1～2 d明顯降低，而后又明顯升高。斷乳后，仔豬對皮下注射促淋巴有絲分裂原（植物血凝素）的反應(yīng)能力也明顯降低，而斷乳后1 d與斷乳后2周相比，仔豬對綿羊紅細(xì)胞刺激產(chǎn)生抗體的能力也明顯降低。這是由于體內(nèi)T細(xì)胞分泌IL-2減少，導(dǎo)致T細(xì)胞分裂受到抑制。隨著斷乳仔豬IL-2的產(chǎn)量的下降，促使其腸道內(nèi)發(fā)生主動的免疫反應(yīng)，或產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)促使機(jī)體釋放出類固醇和組胺。斷乳仔豬體腸道固有層內(nèi)的T細(xì)胞也會受到這種影響。目前，對仔豬在斷乳的過程中出現(xiàn)皮質(zhì)激素改變的研究很少，斷乳對仔豬皮質(zhì)激素的影響值得關(guān)注。其他因素如短暫的食欲下降也會引發(fā)黏膜發(fā)生炎癥。

連續(xù)調(diào)查從出生到7周齡的仔豬腸道菌群變化，發(fā)現(xiàn)從完全母乳喂養(yǎng)到固體飼料的日糧轉(zhuǎn)變是影響腸道菌群變化的主要因素。宏基因組分析發(fā)現(xiàn)斷奶前后多糖降解通路的豐度有顯著改變，斷奶前降解乳汁中多糖相關(guān)的通路豐度較高，斷奶后降解植物多糖的通路較高。在日糧保持不變的情況下，仔豬腸道菌群處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)。而仔豬腸道對日糧抗原過敏從而導(dǎo)致腸道損傷是斷奶后腹瀉的原發(fā)因素，病原微生物感染只是仔豬斷奶后腹瀉的繼發(fā)性原因[8]。大豆類抗原是斷奶仔豬發(fā)生過敏的首要誘因[9]，特別是熱穩(wěn)定性大豆抗原蛋白[10]。大豆抗原蛋白誘發(fā)仔豬過敏反應(yīng)，損傷腸道黏膜，提高腸道通透性，促使sIgA的合成[11]。

斷奶后的仔豬腸道黏膜其免疫功能處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，不同日齡的斷奶仔豬其腸道黏膜的免疫功能有差異。斷奶初期，仔豬腸道黏膜損傷、DC功能紊亂，腸道黏膜免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子分泌發(fā)生變化。斷奶導(dǎo)致的仔豬腸道黏膜Th1型促炎性細(xì)胞因子分泌增多，T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量發(fā)生改變[12]；腸道黏膜形態(tài)發(fā)生的改變，主要表現(xiàn)為腸絨毛變短和隱窩深度增加[13]。斷奶初期的仔豬，其腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白（Occludin）的mRNA表達(dá)量有所下降，從而造成腸道黏膜通透性增強(qiáng)[14]，但是這種紊亂一般是暫時性的，隨著斷奶后期仔豬腸道微生物區(qū)系趨于穩(wěn)定，腸道黏膜免疫功能也逐漸恢復(fù)正常。初生仔豬腸道黏膜和T細(xì)胞等結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育成熟，腸絨毛中幾乎沒有CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)[12]，而仔豬斷奶后自身腸道黏膜免疫因子迅速變化，激發(fā)腸道黏膜免疫功能，從而導(dǎo)致仔豬腸道黏膜免疫細(xì)胞功能的紊亂，一般至斷奶后期逐漸緩解。所以相較于初生仔豬與成年豬，斷奶仔豬的腸道黏膜免疫功能最不穩(wěn)定，斷奶仔豬的腸道最易患病。

4 結(jié)論

為了維持腸道健康，機(jī)體的免疫系統(tǒng)就必須對各種抗原物質(zhì)（有害或是無害的）做出正確反應(yīng)，而不能簡單的對“非自身”抗原做出主動免疫反應(yīng)。雖然還不太清楚這些機(jī)制，但人們已經(jīng)對腸道黏膜上的淋巴結(jié)（派氏集合淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)）和小腸絨毛上的免疫結(jié)構(gòu)有了詳細(xì)的認(rèn)識。新生仔豬的免疫結(jié)構(gòu)發(fā)育還不健全，只有到5～7周后才能發(fā)育完全，這就意味著新生仔豬和斷乳仔豬的免疫力比較低下，需要微生物促進(jìn)其免疫能力的提高。斷乳是豬生命周期中的一個關(guān)鍵階段，斷乳不當(dāng)常常導(dǎo)致仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腸道感染，并導(dǎo)致飼養(yǎng)過程中抗生素過度使用等問題。斷乳時會有很多因素影響到仔豬的免疫能力，進(jìn)而影響到仔豬對食物、共生細(xì)菌和病原微生物的免疫反應(yīng)。斷乳時機(jī)體產(chǎn)生的不當(dāng)免疫反應(yīng)，常會損害腸道的消化吸收功能，并造成疾病。仔豬在3周時免疫系統(tǒng)發(fā)育還不成熟，因此在仔豬5周后斷乳較為適宜。

對于斷乳階段的仔豬來說，黏膜免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定對于建立正常的黏膜免疫耐受和腸道共生菌群是非常重要的。免疫系統(tǒng)、日糧結(jié)構(gòu)和共生菌群之間的相互影響是非常復(fù)雜的，是幾百萬年脊椎動物與自然環(huán)境不斷的共同進(jìn)化所形成的，一旦發(fā)生某種改變就會影響到相互之間的穩(wěn)定性。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境生活方式對孩子的過敏發(fā)生率具有明顯的影響。比如在交通繁忙或是有工業(yè)污染的地區(qū)，過敏的發(fā)生率不高，在農(nóng)村過敏發(fā)生率也低，這可能與動物密切接觸相關(guān)。令人驚訝的是，如果在孩子體內(nèi)檢測到兩種或兩種以上腸道病原的抗體，過敏發(fā)生率也比較低。根據(jù)這些統(tǒng)計結(jié)果，可以提出了一個“衛(wèi)生假設(shè)”，必要的細(xì)菌抗原刺激，對建立一個有效的能夠區(qū)分“無害”和“有害”抗原的免疫系統(tǒng)非常必要。這個提議對養(yǎng)豬生產(chǎn)也同樣具有現(xiàn)實意義。因為新生仔豬黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育不如嬰兒完全，而在更短時間內(nèi)就要發(fā)育到成年豬的水平，這就需要更進(jìn)一步探究仔豬生長過程中細(xì)菌刺激的必要性和可行性。

腸道黏膜免疫對于仔豬腸道和機(jī)體健康發(fā)揮著重要的作用。在商品化養(yǎng)豬生產(chǎn)中，衡量仔豬黏膜免疫系統(tǒng)的功能，以及對日糧和細(xì)菌抗原的反應(yīng)能力，能夠預(yù)測斷乳對仔豬產(chǎn)生的影響。探究仔豬腸道免疫與腸道健康之間的關(guān)系，對仔豬實施科學(xué)斷乳，是未來養(yǎng)豬生產(chǎn)的必然趨勢，將有助于提高仔豬免疫機(jī)能，增強(qiáng)豬群的生產(chǎn)性能，推動養(yǎng)豬業(yè)的良性發(fā)展。