高鵬，趙曉霞

·新型冠狀病毒專欄·

新發(fā)傳染病病原微生物核酸檢測實驗室的思考

高鵬，趙曉霞

050021 石家莊市第五醫(yī)院檢驗科

核酸檢測是傳染病病原學診斷的直接證據之一。保證生物安全是病原學檢測的最基本要求，為此在COVID-19 疫情中，衛(wèi)生行政主管部門專門制定并發(fā)布了《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》[1]。實驗室生物安全是指以防止發(fā)生病原體或毒素無意中暴露及意外釋放的防護原則、技術以及實踐[2]，具體包括基礎設施設備、操作規(guī)范、個人防護以及生物廢棄物處理等方面。遵從生物安全實驗室要求的良好行為規(guī)范，可以有效避免操作人員感染以及可能由此形成的社區(qū)傳播。在具體實踐中，根據《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》要求建設的 PCR 實驗室在開展 2019-nCoV 樣本檢驗過程中存在安全風險[3]。

本文著重從 2019-nCoV 病毒核酸檢測的具體實踐出發(fā)，探討新發(fā)病原微生物核酸擴增檢驗與其他臨床檢驗工作，對實驗室場地分區(qū)和流程的優(yōu)化和再造提出幾點實踐思考，為后續(xù)應對可經呼吸道傳播的高致病性微生物病原學檢測提供一些參考與啟示。

1 實踐思考

隨著近年經濟、技術的快速發(fā)展，以及國外新發(fā)傳染病的警示，檢驗機構對涉及生物安全的標本檢驗無論在硬件還是軟件方面都有了長足的進步。但在 COVID-19 疫情的應對中，仍暴露出不足。在新發(fā)傳染病疫情早期，對病原微生物本身及其疾病診療和轉歸的認識不足，其臨床檢驗工作具有新的要求。為了將新發(fā)疫情病原高風險標本的檢測獨立于日常檢驗工作，不影響正常的診療檢驗程序，新發(fā)傳染病臨床檢驗所涉及的硬件建設流程布局、管理體系、人員配置三個方面都應另行儲備。在新建、改建、提升過程中，應考慮以下三個方面的兼顧統(tǒng)籌，包括基因擴增實驗室與生物安

全實驗室不同側重要求的兼顧、現有通用技術與新興/應急技術的兼顧、病原微生物核酸檢測與高風險標本培養(yǎng)檢測的兼顧。

1.1 兼顧基因擴增檢測與生物安全

檢測未知的高致病性病原微生物，最重要的是操作過程中的生物安全。臨床實驗室要遵從相關標準，如 GB 50346-2011《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》、GB 19489-2008《實驗室生物安全通用要求》、WS 233-2017《病原微生物實驗室生物安全通用準則》。在此基礎上要遵從針對性的指南——《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）》。對于 2019-nCoV，《指南》表明該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理，未經培養(yǎng)的感染性材料的操作，采用生物安全三級實驗室的個人防護。據《人間傳染的病原微生物名錄》中對于大多數第二類病原微生物的操作要求，滅活材料的操作在 BSL-1 實驗室進行，未經培養(yǎng)的感染材料的操作在 BSL-2 實驗室進行，但對 SARS 冠狀病毒滅活材料和其未經培養(yǎng)的感染材料的操作均要求高一級別。在新發(fā)傳染病病原微生物檢測中，采用常規(guī)的 56 ℃處理能否有效滅活病原微生物存在未知性，基于以往 SARS 冠狀病毒的檢測要求，應采用接近 BSL-3 的加強型 BSL-2 實驗室開展檢測。

以 PCR 技術為基礎的病原微生物核酸檢測，在臨床檢驗過程中要遵從相關要求，如《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》。該《辦法》及其附件明確細致地規(guī)定了該類實驗室規(guī)范，保證了檢驗結果的準確性，對于生物安全要求所有操作符合 GB 19489-2008《實驗室生物安全通用要求》。

生物安全二級/三級實驗室和基因擴增實驗室的核心訴求不同，生物安全實驗室注重防范病原微生物的感染、泄漏，而基因擴增實驗室更加注重防范陽性擴增產物的環(huán)境污染，其不同導致底層設計方面具有一定差異。新發(fā)高致病性傳染病的病原微生物檢測要同時兼顧兩種實驗室的要求，具有一定的挑戰(zhàn)性。在兩種類型實驗室的具體操作實踐中，具有一定的差異性，整理如表 1 所示。

設計核心的不同，形成了兩種實驗室不同設計格局。防止病原微生物和擴增產物氣溶膠污染分別是兩種實驗室的防范要點，導致了人流、物流、氣流的不同方向。為兼顧兩者，暫提出兩種方案。

方案一，在標本制備區(qū)和擴增區(qū)進行分區(qū)建設的情況下，另設污染走廊。污染走廊的設置主要有以下兩個用途：一是為實驗人員提供穿梭途徑，回避在潔凈走廊觀察、保障支持的人員；二是更好地管理人流和物流，實驗人員和醫(yī)療廢棄物從污染走廊退出。盡量保證各實驗區(qū)之間無人員穿梭（每個實驗區(qū)配專人作業(yè)）或從污染走廊單向穿梭。各實驗區(qū)密封良好的情況下，保證氣流從標本制備區(qū)流向擴增區(qū)（擴增區(qū)氣壓更低），特定開通氣流定向流動通道并加裝高效 HEPC 濾器，防止擴增區(qū)被病原微生物污染。

表 1 基因擴增檢驗實驗室與加強型生物安全二級實驗室的實踐差異

方案二，樣本制備區(qū)與擴增區(qū)合并為核心工作區(qū)，核心工作區(qū)全部處于生物安全二級防護之中。在具體操作中，可以根據設備對樣本的處理流程不同，建設為一體化整體，或是建設為具有單獨 PCR 擴增間的整體。分別配備整合樣本處理與擴增的設備，或分別進行樣本處理與擴增的獨立設備。加強氣流管理，采用上進下出的氣流組織方案[4]，通過氣簾等方式，形成核心工作區(qū)不同操作區(qū)域的隔離，且在實際工作中，減少不同區(qū)域的穿梭。

以上兩種方案，均需加強擴增產物終末處理管理和室內 PCR 產物氣溶膠污染監(jiān)測，防范擴增產物污染導致的對實驗結果的影響。其中，陽性參照品、陽性標本、陽性擴增產物須經完整包裝，并通過傳遞窗表面消毒后，在污物處理間進行處置。加強實驗室桌面、地面和儀器表面的酸處理（如次氯酸）以及紫外線照射，以降解破壞可能存在的核酸片段。

1.2 兼顧現有技術與新技術

核酸檢測技術主要采用兩種方法：Taqman 熒光 PCR 法和恒溫擴增熒光法[5]。這兩種方法的主要步驟有：核酸提取和上機檢測，前者主要采用全自動或半自動或手動方案完成基因組提取，后者是在擴增-熒光分析儀上完成（反轉錄）基因擴增分析。分步式操作決定了核酸檢測實驗室的格局分布，也是樣本制備與 PCR擴增分區(qū)操作的原因。

一體式操作檢測方案對 PCR 檢測工作提出了新的要求。例如，此次在 COVID-19 疫情中，NMPA 應急審批的國械注準 20203400300 體外診斷試劑提供的檢測方案，其AutoSAT 采用 RNA 實時熒光恒溫擴增檢測技術（SAT），使得核酸提取、純化、擴增檢測、報告結果實現了全程一體化。整個反應在密封的環(huán)境中，提高了實驗的生物安全性。

同樣是一體化方案，具有一定 POCT 特性的快速、小通量方案也進入視野。如在 COVID-19 疫情中，一些分子診斷廠商通過研制已上市設備的配套試劑，獲得了美國 FDA緊急使用授權（EUA），其中有基于Xpert?Xpress Flu/RSV 匣盒技術的診斷方案，其配套的 Xpert?Xpress SARS-CoV-2 試劑盒靶向病毒基因組的多個區(qū)域，可在45 min 左右快速檢測 2019-nCoV。該方案的樣本前處理時間不到 1 min，加入匣盒即可上機。還有基于 ID NOW? 系統(tǒng)的診斷方案，可實現在上機后 5 min 左右報告陽性結果，13 min 左右報告陰性結果[6-7]。以上不同診斷方案雖然分別基于熒光 PCR 法和恒溫擴增法，但其都具有提取-檢測一體化的特征。

在以上兩種方案之外，還有一些新技術方案可能在后續(xù)形成商品化方案上市。如基于 CRISPR 技術的SHERLOCK分子診斷系統(tǒng)[8-9]和 HOLMES 分子診斷系統(tǒng)[6]，曾應用在寨卡病毒、埃博拉病毒檢測中。該兩種方案可以實現快速的“紙片化”的可視分子診斷，相信其技術在整合微流控系統(tǒng)后，可以實現通量化的實驗室檢測。

多種新興核酸檢測技術方案，都以一體化、快速為發(fā)展方向?！斗椒ā吩?2010 修訂版中特別增加了“采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可合并”的內容。后續(xù)實驗室建設區(qū)域合理劃分的基礎上，管理體系和流程方案的發(fā)展要與之相配套。

1.3 兼顧核酸檢測與高風險標本培養(yǎng)檢測

對疑似或確證患者的呼吸道標本的細菌培養(yǎng)操作風險較大，在實踐中，對此類標本的檢測，應設置合理的硬件設施設備與軟件流程。已有專家共識提出，條件允許時，新冠樣本的檢驗應安置在相對獨立的區(qū)域[7]。在此建議，可以在核酸檢測的加強型 BSL-2 實驗區(qū)增加細菌檢測房間，配備基本的細菌分離、培養(yǎng)、涂片設備，對應的鏡檢過程，由于護目鏡、防護面屏極易對視野和視線造成影響，建議將樣品玻片經固定、封片、紫外照射等滅活操作后，經傳遞窗轉至常規(guī)微生物實驗室進行。在本次阻擊 COVID-19 疫情的應急方案中，對疑似或確證患者的呼吸道標本的處理人員采用BSL-3 個人防護，實驗過程既占用微生物 BSL-2 實驗室，又需要核酸檢測實驗室，對人員、環(huán)境、防護用品造成不必要的消耗。通過兼顧病原微生物核酸檢測與高風險標本培養(yǎng)檢測，避免高風險標本培養(yǎng)操作占用常規(guī)微生物 BSL-2 實驗室，是疫情常態(tài)化防控的需求。

2 討論

在 COVID-19 疫情早期，核酸檢測通常在疾控機構和傳染病專科醫(yī)院開展，相對其他基層醫(yī)療機構，此類機構人員具有較強的生物安全意識，能夠按照相關指南，自主地應急升級、改造現有設施設備，建立良好的操作規(guī)范及檢驗流程。通過合理的流程設計和良好的操作規(guī)范，可以在一定程度上彌補應急狀態(tài)下設施設備不夠完備的缺點。然而，許多非傳染病醫(yī)院和基層醫(yī)療機構在開展 2019-nCoV 核酸檢測過程中，仍應通過合理設置設施設備，強化人員的操作規(guī)范來降低生物安全風險。在核酸檢測實驗室升級、建設過程中，強調生物安全設計，將幫助此類工作人員更好地實現生物安全。

應急升級、改造病原微生物檢驗實驗室的措施，由于條件受限、考慮不足等問題，在實際工作中增加了生物安全風險。隨著疫情狀態(tài)進入常態(tài)化，在恢復正常診療秩序要求下，建設加強型 BSL-2 病原微生物檢測實驗室，既滿足現有的 2019-nCoV 核酸檢測要求，也為下一次可能的疫情暴發(fā)做好準備。當然，儲備式建設可以有冗余，但也應兼顧成本。在考慮省市級疾控機構和定點醫(yī)院建立獨立的加強型 BSL-2 實驗室外，可以考慮各級疾控機構配置相應的可移動式生物安全實驗室。在疫情出現時，可移動式生物安全實驗室可以充分發(fā)揮其快速機動的特點，快速移動到疫情緊迫區(qū)域，及時就地展開病原微生物檢測工作，形成檢驗能力[8]。生物安全設施設備建設應保持長期性，堅持公益性和應急屬性。

類似生化檢驗的一體式方案，連續(xù)化解決方案是核酸檢測的一個重要發(fā)展方向。隨著疫情防控要求精準化，隨到隨檢、快速出具結果報告的檢測策略越來越受重視[9]。該檢測策略需要可將樣本處理、核酸提取及擴增檢測聯(lián)為一體的自動化分析儀。在實驗室布局方面，根據《方法》2019 修訂內容，將制備、擴增、分析檢測三區(qū)合并為一區(qū)，則生物安全和核酸檢測的防范重點便統(tǒng)一在同一區(qū)域——核心實驗區(qū)，并由此實現兼顧統(tǒng)一。

歐美國家對病原微生物核酸檢測的實驗室布局有多樣化的選擇和設計。既有理想化的 4 區(qū)分離方案，也有 3 區(qū)分離和 2 區(qū)分離方案。在 2 區(qū)分離方案中，試劑準備和樣本制備可以安排在同一區(qū)域。在一例埃博拉移動式實驗室的配置中，包括主實驗室、試劑準備室、模板加樣室和 PCR室[10]。主實驗室作為整體包含其他三室，并可以分別進入三室，無緩沖區(qū)域。核心區(qū)負責樣本處理如 RNA 提取，還包括 GeneXpert 檢測。試劑準備室和模板加樣室非常小，僅配有一個層流柜保證潔凈操作。該設計方案與本文提出的樣品制備與擴增設置為一個區(qū)域的設計理念相近。另一方面，國外廠商不斷更新的核酸檢測設備，無論是通量較小的GeneXpert，還是與現有常用 96 通道同樣通量的 Cobas?8800，都對實驗室整體一區(qū)的布局有促進作用。

本文在探討過程中，更多地關注在生物安全方向，一定程度上弱化了核酸檢測工作中防止檢驗樣本被污染的工作準則。為了同步提高生物安全和核酸檢測準確性，除了臨床檢驗人員的努力，還需要檢驗儀器與試劑開發(fā)設計的配合，優(yōu)化整合從采樣、滅活，到標本處理、標本上機，再到核酸分析的全流程。最大程度完成樣品在封閉負壓環(huán)境的全自動處理，尤其是開帽操作和易產生氣溶膠的高風險操作（痰、便等類型標本的消化操作等）；最大程度實現檢測試劑的單測試預裝，避免分裝等操作帶來的交叉污染。另外，雖然設施設備的硬件建設和儲備非常重要，但更要加強生物安全的管理以及人員培訓，確保生物安全和檢測結果的雙達標。

注：本文僅代表作者個人觀點，不代表供職單位立場。

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趙曉霞，Email：xiami49568@qq.com

2020-08-24

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.001