龐欣欣，彭紫凝，邢玉鳳，石秀杰，張雅歌，韓佳瑞

·論著·

基于網絡藥理學聯(lián)合GEO數(shù)據分析探討銀杏葉治療糖尿病腎病的作用機制

龐欣欣，彭紫凝，邢玉鳳，石秀杰，張雅歌，韓佳瑞

450002 鄭州，河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腎病科（龐欣欣、韓佳瑞）；450046 鄭州，河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院（彭紫凝、邢玉鳳、石秀杰、張雅歌、韓佳瑞）

通過網絡藥理學研究方法，聯(lián)合 GEO 數(shù)據庫分析驗證，探討中藥銀杏葉治療糖尿病腎病的作用機制。

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺篩選銀杏葉的有效成分和靶點，通過GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、GAD 等數(shù)據庫查找與糖尿病腎病相關的靶點。利用 Cytoscape 軟件分析銀杏葉治療糖尿病腎病的作用靶點與有效成分之間關系網絡。分析 GEO 數(shù)據庫芯片，驗證關鍵靶點。通過 DAVID 數(shù)據庫分析銀杏葉治療糖尿病腎病的有效靶點的生物學功能和作用機制。

根據口服利用度和藥物相似性原則篩選出銀杏葉有效成分 27 個，篩選出的有效成分作用靶點 201 個。在 GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、GAD 等數(shù)據庫中篩選出有關糖尿病腎病靶點 10 859 個。通過 Cytoscape 軟件篩選，得到銀杏葉治療糖尿病腎病的關系網絡共 621 條。GEO 芯片分析驗證，前 5 個關鍵靶基因 VEGFA 和 CASP3 具有差異顯著性。采用 DAVID 數(shù)據庫進行 GO 和 KEGG 分析，得到晚期糖基化終末產物及受體、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、炎癥、細胞凋亡等關鍵信號通路。

該研究初步揭示，銀杏葉通過多靶點、多通路治療糖尿病腎病，其有效作用靶點主要通過蛋白激酶、炎癥因子、血管內皮生長因子等作用于多條信號通路，其中 AGEs-RAGE信號通路是其發(fā)揮治療作用的重要通路。銀杏葉可能直接或間接參與調節(jié)氧化應激、炎癥、細胞凋亡等作用機制治療糖尿病腎病，為今后分子生物學實驗奠定了基礎。

銀杏葉； 糖尿病腎??； 網絡藥理學； GEO 數(shù)據； 作用機制

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病患者的微血管慢性并發(fā)癥之一，目前已成為導致終末期腎臟病的主要病因，其發(fā)病率正逐年增加[1-2]。DKD 發(fā)病機制復雜，可能涉及炎癥、氧化應激、糖脂代謝異常、白細胞介素（interleukin，IL）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種機制[3]。目前臨床尚無針對 DKD 的有效治療方法[4]，多數(shù)患者不可避免地進入透析，探討新的干預手段迫在眉睫。

銀杏葉（Ginkgo Folium）是我國特有的植物類中藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，銀杏葉具有多種生物活性，能降低脂質對血管內皮細胞的損壞，對預防和治療多種慢性疾病有重要意義[5-6]。本課題組既往綜述了銀杏葉治療 DKD 的研究進展，發(fā)現(xiàn)銀杏葉對 DKD 治療效果良好，具有較大的研究意義[7]。我們進一步通過鏈脲佐菌素（STZ）誘導的 1 型糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物 EGB761 可以減少 DKD 小鼠蛋白尿并減輕腎小管損傷，改善 DKD 腎臟病理損害，從而發(fā)揮治療 DKD 的作用[8]。但是目前對于銀杏葉治療 DKD 的藥物基礎與其涉及的治療機制仍不完全明確，有待進一步的深入探討。

網絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，對生物系統(tǒng)的網絡分析，可用以探索藥物治療疾病的物質基礎以及潛在的分子機制[9]。本研究通過網絡藥理學的方法挖掘銀杏葉治療 DKD 的有效靶點，采用 GEO 數(shù)據庫驗證靶點可行性，對預測全部有效靶點進行 GO 和 KEGG 富集分析，從而為銀杏葉多成分、多靶點、多功能、多通路地治療 DKD 的作用機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 銀杏葉活性成分的篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）挖掘銀杏葉的所有化學成分，根據各個成分的吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion），即 ADME 參數(shù)篩選有效成分。設置口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥ 30%，藥物相似性（drug like，DL）≥ 0.18[10]。

1.2 銀杏葉和 DKD 作用靶點的篩選

通過 TCMSP 數(shù)據庫，以“Ginkgo Folium”為關鍵詞，篩選銀杏葉有效成分作用靶點。GeneCards 是關鍵公共集成數(shù)據庫，包括基因組學和臨床基因信息等多基因信息[11]。以“Diabetic kidney disease”和“Diabetic nephropathy”為關鍵詞在 GeneCards 里篩選與 DKD 有關的所有靶點，并在 OMIM、TTD、DrugBank、GAD 等數(shù)據庫中適當篩選補充[12]。

1.3 蛋白互作網絡構建篩選關鍵靶點

中藥調控機體的具體機制復雜，有多種方式，其中蛋白質-蛋白質相互作用關系（protein-protein interaction，PPI）能夠直觀探索蛋白靶點之間的關系[13]。STRING 數(shù)據庫則是預測 PPI 關系的重要平臺。設置篩選參數(shù)為：生物機體選擇為人類，最低要求交互分數(shù)設置最高置信度 0.4。

1.4 銀杏葉治療 DKD 的網絡調控可視化

基于銀杏葉和 DKD 的相互作用靶點數(shù)據，引入銀杏葉可作用于 DKD 的有效成分，提取兩者交集，采用 Cytoscape 3.7.2 軟件把這些數(shù)據制作成可視化網絡圖，挖掘其相互之間的作用關系。即得到銀杏葉治療 DKD 的疾病-藥物-分子-靶點調控網絡圖。

1.5 GEO 芯片差異基因驗證

利用 GEO 數(shù)據庫，搜索“Diabetic kidney disease”，物種選擇人類，選擇基因數(shù)據，下載基因矩陣與平臺數(shù)據文件，運用 Perl 腳本將下載的探針對應為基因 ID。采用 R 語言中“l(fā)imma”安裝包，篩選在 DKD 和正常組模型中上調或下調的差異基因，獲取上調和下調的差異基因，其中限定條件< 0.05。

1.6 功能富集分析與通路分析

DAVID（database for annotation, visualizationand integrated discovery）數(shù)據庫廣泛應用于基因注釋，可通過該數(shù)據庫挖掘基因與疾病的相關性。通過 DAVID 工具進行 GO 和 KEGG 通路富集分析，能夠分析關鍵靶基因的生物學功能特性及作用的具體通路。

2 結果

2.1 銀杏葉有效成分 ADME 分析

通過 TCMSP 數(shù)據庫，檢索出銀杏葉所有成分，依據 OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18 篩選出銀杏葉有效成分 27 個（表 1）。

2.2 銀杏葉和 DKD 的相關靶點檢索

銀杏葉 27 個有效成分中，20 個具有對應的靶點。靶點進行基因注釋，刪除重復值，得到201 個銀杏葉靶點。同樣，在 GeneCards、OMIM 等數(shù)據庫中篩選得到 10859 個 DKD 有效相關靶點。采用工具 Venny 2.1.0 做出銀杏葉有效成分靶點與 DKD 相關靶點關系的 Venn 圖（圖 1）。

2.3 銀杏葉-DKD 作用靶點 PPI 關系分析

采用 STRING 數(shù)據庫，對獲得的 193 個銀杏葉-DKD 相互作用靶點進行 PPI 分析，得到 PPI 網絡圖（圖 2），其中包含了 193 個節(jié)點和 3246 條邊，平均節(jié)點度數(shù) 33.6。取其中富集節(jié)點數(shù)目最多的前 30 個靶點，做出柱狀圖，得到前核心靶點（圖 3），主要有蛋白激酶、炎癥因子、血管內皮生長因子、細胞凋亡相關因子、細胞生長因子等。

2.4 銀杏葉治療 DKD 網絡可視化分析

采用 Cytoscape 軟件進行網絡可視化。納入上述 PPI 網絡篩選的 193 個基因，以及 20 個銀杏葉可用有效成分，得到各個節(jié)點之間的疾病、藥物、分子和靶點關系共 621 條（圖 4）。

2.5 GEO 芯片差異基因驗證

獲取 GEO 數(shù)據庫下載的 GSE30122 芯片與平臺數(shù)據。共計樣本 69 個，其中正常樣本 50 個，DKD 樣本 19 個。分析得到具有顯著性差異基因有 638 個，基因表達上調為紅色，下調為綠色，得到火山圖，如圖 5。通過分析差異基因，驗證銀杏葉-DKD 前 5 關鍵靶點，其中 VEGFA 和 CASP3 具有顯著性差異，做出箱式圖，如圖 6，值表示差異性。

表 1 銀杏葉有效成分

DKD Ginkgo Folium

Figure 1 Venn diagram of the relationship between the target of active ingredients of Ginkgo Folium and DKD

2.6 銀杏葉治療 DKD 的機制分析

采用 DAVID 工具對銀杏葉治療 DKD 進行 GO 分析和 KEGG 信號通路分析。得到銀杏葉可治療 DKD 的作用靶點的生物學功能 163 種，綜合分析后取前 20 種功能特性，得到銀杏葉有效成分靶點主要通過 DNA 結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶 II 型特異性、細胞因子受體結合性、泛素樣蛋白連接酶結合性、細胞因子活性等生物學功能特性治療 DKD（圖 7）。銀杏葉治療 DKD 信號通路有 172 條，分析顯示有效靶點主要在晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end products，AGEs）-受體（receptor of AGEs，RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇 3 激酶-蛋白激酶 B（PI3K-Akt）信號通路等。前20 個靶點如圖 8，其中氣泡或柱形圖顏色越紅，則校正值越高，顯著性越強，氣泡越大或柱形越長，則該生物學功能或該通路富集的靶點越多。根據排名，在 KEGG Pathway 數(shù)據庫找到這些靶點最關鍵的 AGEs-RAGE 信號通路圖，同時用紅色表示銀杏葉靶點在該信號通路上具體作用點（圖 9）。

圖 2 銀杏葉治療 DKD 相關靶點的 PPI 關系圖

Figure 2 PPI map of DKD-related targets in Ginkgo Folium therapy

ICAM1BCL2L1HMOX1NOS3ARRELAIL10MMP2MAPK14PPARGERBB2CCL2IL1BFOSCCND1CATCXCL8ESR1MMP9PTGS2MAPK1EGFMYCMAPK8EGFRJUNCASP3VEGFAIL6AKT1 0 20 40 60 80 100 120 140

Figure 3 The core targets of DKD-related targets in Ginkgo Folium therapy (The number represents critical nodes of the core targets in the PPI map)

圖 4 銀杏葉-DKD-有效成分-靶點網絡關系圖（六邊形代表銀杏葉，菱形代表 DKD，三角形代表銀杏葉 20 個有效作用成分，圓形代表銀杏葉治療作用于 DKD 的 193 個靶點）

Figure 4 Network diagram of Ginkgo Folium-DKD-active components-targets (hexagon represents Ginkgo Folium, diamond represents DKD, triangle represents 20 active ingredients of Ginkgo Folium, circle represents 193 DKD targets of Ginkgo Folium treatment)

圖 5 GSE30122 芯片分析火山圖

Figure 5 GSE30122 chip to analyze volcano map

Log2 差異倍數(shù)Log base 2 differential2 1 0 –1 –2 –3 VEGFA CASP3

Figure 6 Analysis of key target genes VEGFA and CASP3 (*< 0.01)

圖 7 銀杏葉治療 DKD 的相關生物學功能（count 值代表與該生物學功能相關的靶點數(shù)量；P.adjust 表示顯著性）

Figure 7 The biological function of DKD in Ginkgo Folium therapy (Count represents the number of targets associated with this biological function; P.adjust stands for significance)

圖 8 銀杏葉治療 DKD 關鍵信號通路（P.adjust 表示顯著性）

Figure 8 Ginkgo Folium treatment of DKD key signaling pathway (P.adjust stands for significance)

圖 9 AGEs-RAGE 信號通路圖（紅色表示銀杏葉在信號通路上的作用靶點）

Figure 9 AGEs-RAGE signaling pathway map (red represents the target of Ginkgo Folium leaves on the signaling pathway)

3 討論

DKD 是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，35% ~ 40%的糖尿病患者會發(fā)展為 DKD[1]。DKD 發(fā)病機制目前尚不完全清楚，臨床治療困難，患者最終需要進行腎移植或依賴腎透析，預后不良[3]。DKD 隨著病情遷延會出現(xiàn)一系列如貧血、心力衰竭等并發(fā)癥，影響患者生活質量，嚴重則危及生命[14]。

DKD 依據其臨床表現(xiàn)可歸屬為中醫(yī)學中“消渴”、“水腫”等疾病范疇。病因與消渴病因相似，多是消渴病日久不愈，病情發(fā)展的結果。其基本病機是本虛標實，治療上當以養(yǎng)陰活血、化瘀利水等為主[15]。中藥銀杏葉性味甘、苦、澀、平，功效主要為活血化瘀、化濁降脂，臨床應用符合 DKD 的中醫(yī)病機[16]。本課題組前期開展銀杏葉提取物 EGB761 對 DKD 小鼠影響的實驗研究，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可以顯著改善 DKD 小鼠精神狀態(tài)較差、反應遲鈍、多飲多食多尿等癥狀，減輕 Scr、BUN、24h Pro 等腎功能指標的表達，改善 DKD 腎臟的病理損傷，抑制 DKD 腎小管損傷的靈敏生物標志物尿 β2-MG、RBP4 和 NGAL 的升高，證實銀杏葉提取物 EGB761 可以顯著改善 DKD 小鼠腎損害[8]。雖然目前已有多項研究表明銀杏葉及其提取物能夠治療 DKD，但是其藥理作用及機制的研究較為局限，缺乏銀杏葉發(fā)揮治療作用的藥物基礎、信號通路及關鍵靶點的文獻報道。

網絡藥理學具有與中醫(yī)藥學基本特點一致的整體性和系統(tǒng)性，包含系統(tǒng)生物學理論，是一門新興學科[17]。本研究通過網絡藥理學的方法，得到銀杏葉治療 DKD 的成分有 20 種，其中芝麻素具有降低甘油三酯、改善血管肥厚、產生抗氧化作用等多種功效[18]；異鼠李素具有多種藥理學活性，能夠在體內發(fā)揮抗炎、清除自由基、減輕氧化應激作用[19-20]；β-谷甾醇在機體中參與多通路作用而具有抗氧化及降脂作用[21]；山奈酚和木犀草素能夠抑制腎組織細胞凋亡和炎癥反應，緩解糖尿病腎病動物模型腎組織病理損傷[22]。依據本研究銀杏葉-DKD 的 PPI 關系分析的核心靶點，得到銀杏葉治療 DKD 有效成分主要通過作用多個靶基因發(fā)揮作用，如 AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3 等。目前研究認為 AKT 參與自噬的調節(jié)，與 DKD 密不可分[23]。Cui 等[24]通過一項薈萃分析認為炎癥因子 IL-6 與DKD 患病風險關系密切。另有研究認為 VEGFA 刺激體內血管通透性增強進而促進蛋白尿的排泄、CASP3 直接參與了腎臟細胞凋亡過程[25-26]。通過 GEO 數(shù)據庫臨床樣本 GSE30122 芯片分析，篩選差異基因，驗證了銀杏葉-DKD 前 5 的關鍵靶點中，VEGFA 和 CASP3 具有顯著性差異，進一步證實了本研究的結論。

通過 GO 分析，把銀杏葉有效靶點的生物學特性如 DNA 結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶 II 型特異性、細胞因子受體結合性、泛素樣蛋白連接酶結合性等聯(lián)系起來，結果表明銀杏葉-DKD 相關靶基因通過多種生物學功能影響 DKD。KEGG 分析得到銀杏葉治療 DKD 涉及多個通路，如 AGEs-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。其中最關鍵的為 AGEs-RAGE 信號通路。在 AGEs-RAGE 信號通路中，由一系列蛋白質、脂質、氨基酸等大分子物質經過多重反應最后形成的不可逆的晚期糖基化終末產物在 DKD 患者體內大量累積，參與 DKD 的進展。AGEs 主要與受體 RAGE 結合[27]，激活下游通路加重 DKD 腎臟血管損傷，促進腎功能惡化，提升心血管并發(fā)癥發(fā)生的風險，最終增加 DKD 死亡率[28-29]。AGEs-RAGE 信號通路下游可直接作用于 NADPH，刺激產生大量的活性氧，促使氧化應激。一系列反應促分裂素原活細胞外信號調節(jié)激酶和 P38、VEGF 等介導的信號通路，使核轉錄因子 NF-κB 發(fā)生磷酸化而活化，刺激引起大量生長因子，以及促炎細胞因子（包含 IL-1、IL-6）等高度表達，加快機體損傷[30-31]。同時，NADPH 誘導的氧化應激反應上調了凋亡因子 Bax 蛋白的表達，下調了凋亡抑制因子 Bcl-2 表達，促使細胞凋亡。因此，AGEs-RAGE 通路在 DKD 的發(fā)病機制中占有重要地位，這可能是銀杏葉治療 DKD 的關鍵機制。

綜上所述，本研究通過對銀杏葉治療 DKD 的網絡藥理學分析，結果發(fā)現(xiàn)銀杏葉內含芝麻素、異鼠李素等多種有效成分可能是其治療 DKD 的關鍵組成，進一步發(fā)現(xiàn)銀杏葉通過 AKT1、IL-6、VEGFA 和 CASP3 等多靶點參與多種生物學功能特性，涉及 AGEs-RAGE 通路等多條通路。證實銀杏葉通過多成分，多靶點，多通路，協(xié)同作用參與調節(jié)氧化應激、炎癥、細胞凋亡等復雜機制參與 DKD 機制，為銀杏葉相關藥物用于 DKD 臨床治療提供理論基礎。

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Mechanism of Ginkgo Folium on diabetic kidney disease based on network pharmacology with GEO data analysis

PANG Xin-xin, PENG Zi-ning, XING Yu-feng, SHI Xiu-jie, ZHANG Ya-ge, HAN Jia-rui

To study the mechanism of Ginkgo Folium in the treatment of diabetic kidney disease (DKD) by network pharmacology with GEO data analysis and verification.

The effective components and targets of Ginkgo Folium were screened by the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank and GAD databases were used to explore the potential targets of Ginkgo Folium related to DKD. The relationship between targets and active components of Ginkgo Folium in the treatment of DKD was analyzed by Cytoscape software. GEO database was analyzed to verify key targets. The biological function and mechanism of Ginkgo Folium in the treatment of DKD were analyzed using DAVID database.

27 active ingredients and 201 targets were screened according to the principle of oral bioavailability and drug like of these active ingredients. 10 859 DKD related targets were screened in the GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank and GAD databases. 621 correlations among DKD, drug, molecule and target were screened out for the treatment of DKD with Ginkgo Folium by Cytoscape software. GEO data analysis confirmed top five key targets, from which VEGFA and CASP3 had significant differences. GO and KEGG analysis were carried out by DAVID database, and the results showed that the key signaling pathways mainly included those correlated with AGEs-RAGE, fluid shear stress, atheroscierosis, inflammation and apoptosis, etc.

This study preliminarily reveals that Ginkgo Folium might protect against DKD through multiple targets and pathways. Its effective targets mainly involve multiple signaling pathways including protein kinases, inflammatory factors, vascular endothelial growth factors and other factors, among which the AGEs-RAGE signal pathway is an important pathway. Ginkgo Folium might be directly or indirectly involved in the regulation of oxidative stress, inflammation, apoptosis and other mechanisms of action in the treatment of DKD, laying a foundation for future exploration in molecular biology experiments.

Ginkgo Folium; Diabetic kidney disease; Network pharmacology; GEO data; Mechanism

HAN Jia-rui, Email: HanJR2018@126.com

河南省高等學校重點科研項目計劃（19A360009）；河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關）項目（202102310171、202102310505）；國家中醫(yī)臨床研究基地科研項目（2019JDZX068）；河南中醫(yī)藥大學 2019 年度研究生科研創(chuàng)新項目（2019KYCX024）；河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項目（2019ZYBJ17）；全國中醫(yī)藥創(chuàng)新骨干人才培訓項目

韓佳瑞，Email：HanJR2018@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.005

Author Affiliation:Department of Nephrology, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine/The Second Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, China (PANG Xin-xin, HAN Jia-rui); The Second Clinical Medical College of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China (PENG Zi-ning, XING Yu-feng, SHI Xiu-jie, ZHANG Ya-ge, HAN Jia-rui)

2020-08-03