李井春，李 琦，王 碩，郭銘輝，李雁冰，魏國(guó)生 *

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

1 豬精液常溫保存的原理

豬精子質(zhì)膜的磷脂分布的不均勻，低溫會(huì)造成精子的冷休克現(xiàn)象。在2011年1月1日實(shí)行的《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》（GB/T 25172-2010）中定義豬的常溫精液為：經(jīng)稀釋后在16～18 ℃下短期保存，仍具有受精能力的精液。國(guó)家相關(guān)技術(shù)規(guī)范的制定有利于豬精液常溫保存技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。Zou等（2000）研究發(fā)現(xiàn)豬新鮮精液在15 ℃和20 ℃保存效果較好。崔茂盛等（2018）研究發(fā)現(xiàn)豬精液在4 ℃保存時(shí)，使用實(shí)驗(yàn)室自研保存液，在10 d后精子的活力依然可以達(dá)到70 %。潘越博等（2010）研究發(fā)現(xiàn)豬精液在17 ℃下保存取得了良好的保存效果，其主要原因是豬精子在該溫度下代謝速率變慢，使得其受代謝產(chǎn)物的影響變小，同時(shí)合適的溫度可以避免低溫對(duì)于精子質(zhì)膜的傷害。

稀釋液作為豬精液保存的重要組成部分，具有為精子供能、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抗氧化、維持pH和避免微生物污染等功能。林峰等（2012）研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)慕档途颖４姝h(huán)境中的pH比中性環(huán)境更有益于延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間，這是因?yàn)檫m宜的酸性環(huán)境可以有效降低精子的能量消耗。以此為基礎(chǔ)，在精液稀釋粉中加入適量酸性物質(zhì)，調(diào)整精子所處的內(nèi)環(huán)境，可以達(dá)到延長(zhǎng)精子保存時(shí)間的目的。而稀釋液中的其他成分如緩沖劑、懸浮劑和糖類等，則是模擬精清的成分以維持精子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、防止精子沉積和為精子供能。為了進(jìn)一步地延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間，減小微生物對(duì)于精子保存的影響，除注意操作流程的規(guī)范外，還要添加部分的抗生素。隨著我國(guó)中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，部分中藥提取物開始逐步應(yīng)用于精液保存，來替代抗生素，以減小細(xì)菌的抗藥性。除中藥外，抗菌肽在精液保存上的研究也有報(bào)道，在未來可能會(huì)有更好更高效的抑菌藥物應(yīng)用到豬精液保存中。

2 影響豬精液常溫保存物理因素

豬精液的常溫保存常受到溫度、pH、滲透壓等因素的影響。由于豬精子獨(dú)特的質(zhì)膜特性，其對(duì)冷凍和低溫刺激極為敏感。低溫會(huì)導(dǎo)致豬精子產(chǎn)生冷休克現(xiàn)象，冷休克能降低精子運(yùn)動(dòng)速度和精子活力，且這種現(xiàn)象是不可逆的。Lozaron等（1998）確定了豬精液的臨界冷休克溫度為12 ℃。Zou等（2000）發(fā)現(xiàn)在精液稀釋前將精液置于室溫或20 ℃條件下數(shù)小時(shí)，可以使精子對(duì)低溫產(chǎn)生一定的耐受能力，這對(duì)延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間、保證精子的存活率和頂體的完整性有一定積極的作用，但其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。通過相關(guān)學(xué)者不斷地摸索與研究，逐漸確立15～20 ℃為豬精液常溫保存的最適范圍，而16～18 ℃在生產(chǎn)中應(yīng)用最為普遍。當(dāng)豬精液在較高溫度下時(shí)，其質(zhì)量與精子質(zhì)膜上的熱休克蛋白有關(guān)，溫度低于12 ℃或超過20 ℃則會(huì)降低精液的保存時(shí)間以及精液的品質(zhì)。未稀釋的新鮮豬精液的pH在7.2～7.5之間，適當(dāng)?shù)牡蚿H可以降低精子的代謝和運(yùn)動(dòng)水平。在豬附睪內(nèi)精子可以存活30～60 d，這與附睪內(nèi)環(huán)境呈弱酸性（6.2～6.8）有很大的關(guān)系。豬精子的滲透壓在290～300 mosM，可耐受的滲透壓為240～380 mosM。精子可以在附睪中存活較長(zhǎng)的時(shí)間，還與附睪中的滲透壓偏高有關(guān)。附睪中的滲透壓為400 mosM，使精子發(fā)生脫水現(xiàn)象，導(dǎo)致精子缺乏運(yùn)動(dòng)所需最低水分，使得精子不能運(yùn)動(dòng)，但在體外條件下精子卻無法承受這種高水平的滲透壓，這可能與精子是否獲能以及精子膜上的胞質(zhì)小體有關(guān)。稀釋液的離子濃度對(duì)維持滲透壓沒有太大的作用，但離子濃度過高會(huì)造成精子表面蛋白溶解和脫落，給精子造成損傷。目前，研究團(tuán)隊(duì)通過物理調(diào)節(jié)精液保存壓強(qiáng)的方法，如負(fù)壓條件對(duì)豬精液常溫保存效果的研究結(jié)果表明，-0.04 MPa的壓強(qiáng)顯著延長(zhǎng)精液保存時(shí)間和提高精液保存的質(zhì)量。從實(shí)際效果上負(fù)壓保存降低了精液的稀釋液中氧含量，降低精子代謝活動(dòng)水平，減少精液中過氧化氫的含量。

3 影響豬常溫精液保存微生物因素

在精液的體外保存過程中不可避免會(huì)受到細(xì)菌等微生物的影響。豬精液常溫保存稀釋劑中一般含有葡萄糖，其作用是為精子的生命活動(dòng)供能，但在精液常溫保存的溫度條件下葡萄糖同樣也會(huì)被絕大多數(shù)微生物所利用，其作用方式包括競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致精子活力下降、含有凝集因子使精子聚集、降低環(huán)境滲透壓造成頂體腫脹以及無氧發(fā)酵使糖分產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致pH降至酸性

（5.7～6.4）等。一般排除特殊環(huán)境的影響，精液中的微生物主要以大腸桿菌和少量的葡萄球菌屬和絲狀真菌為主。大腸桿菌等革蘭氏陰性菌對(duì)精液保存的影響較大，會(huì)造成精液質(zhì)量下降。實(shí)際上，除從健康公豬采集精液時(shí)其生殖器所攜帶的細(xì)菌外，大部分細(xì)菌來自于采精室以及采精人員。另外在精液稀釋時(shí)，也存在使細(xì)菌含量增加的潛在危險(xiǎn)因素，比如敞開的采精杯、調(diào)整稀釋液溫度、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程靠近空氣壓縮機(jī)部分表面高溫等等都會(huì)造成精液質(zhì)量的下降。除了動(dòng)物來源的細(xì)菌外，非同源性細(xì)菌也越來越受到人們的關(guān)注。最近的一項(xiàng)研究顯示，2010—2011年期間，在24個(gè)歐洲人工智能中心收集的344個(gè)豬精液樣本中，有26 %的精液被檢測(cè)出細(xì)菌污染。檢測(cè)出21種不同的革蘭氏陰性菌，其中18種菌對(duì)常用抗生素表現(xiàn)出耐藥性。這些細(xì)菌大多是與人類和動(dòng)物感染相關(guān)的病原體，研究指出了細(xì)菌傳播到精液中的潛在危險(xiǎn)。值得注意的是，受污染豬精液中的細(xì)菌有4.5%來源于原精液，這表明大部分細(xì)菌來源于采精后的環(huán)節(jié)。當(dāng)多種微生物污染精液時(shí)，精子活力會(huì)嚴(yán)重下降，有效保存時(shí)間會(huì)縮短，使用這樣的精液進(jìn)行人工授精會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響。

4 常溫保存的豬精液的稀釋方法

常溫保存豬精液產(chǎn)品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 25172-2010）為：地方品種劑量為40～50 mL，其他品種劑量為80～100 mL，精子活力均要≥60%。每劑量中直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)：地方品種≥10億，其他≥30億。稀釋后精液的質(zhì)量取決于稀釋液的優(yōu)劣和操作是否合乎標(biāo)準(zhǔn)。因此，在進(jìn)行豬精液的稀釋操作前要保證操作環(huán)境的干凈和公豬的健康。采集精液前要使用雙蒸餾水配制稀釋液，置于水浴鍋中進(jìn)行加熱攪拌處理。稀釋液溫度必須與精液溫度相同，之后再進(jìn)行稀釋，以精液溫度為準(zhǔn)來調(diào)節(jié)稀釋液溫度，精子對(duì)于溫度非常敏感，精液稀釋過程中溫度的變化對(duì)精液質(zhì)量有著深遠(yuǎn)的影響。在精液的稀釋過程中如果原精液的密度過大，應(yīng)進(jìn)行二次稀釋防止稀釋效應(yīng)的發(fā)生。如果稀釋的比例過大會(huì)導(dǎo)致保護(hù)精子的部分活性物質(zhì)密度下降，其中不少是抑制精子獲能成分。此外，稀釋比例過大還會(huì)導(dǎo)致精子內(nèi)部陰陽(yáng)離子失衡使精子表面帶電增多，使精液保存效果下降。稀釋比例過小則會(huì)導(dǎo)致精子后期供能不足。合理的稀釋比例不僅可以為精子提供合適的內(nèi)部環(huán)境，也在一定程度上延長(zhǎng)了精子的保存時(shí)間。Jian Du等（2015）研究證明原精液與稀釋液用1:1～1:4的體積比進(jìn)行稀釋時(shí)可抑制精子的早期獲能，延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間。稀釋后的成品豬精液需要一段時(shí)間來進(jìn)行緩慢降溫，如果精液冷卻得太快，這將導(dǎo)致脂質(zhì)與蛋白相分離，從而改變膜蛋白和膜通透性。稀釋后的精液須避光保存，防止精子受陽(yáng)光照射死亡以及震動(dòng)造成的斷尾。每12 h緩慢搖勻一次，防止精子的凝集效應(yīng)。稀釋后的精子的活率會(huì)隨保存的時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸下降，應(yīng)盡早完成輸精操作，提高精子的使用效率和母豬受胎率。

5 常溫保存的豬精液稀釋劑成分的研究現(xiàn)狀

5.1 供能物質(zhì)

糖類是生物界最廣泛的供能物質(zhì)。糖類具有價(jià)格低廉、易采購(gòu)的優(yōu)點(diǎn)，因此稀釋液中添加葡萄糖、果糖或者海藻糖在豬精液保存中得到了廣泛的應(yīng)用。豬精子常溫保存過程中因其自身的代謝，需要不斷的消耗能量，而糖類是其能量的主要來源。此外糖類物質(zhì)還具有維持滲透壓、參與膜上物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及作為部分蛋白的功能基團(tuán)等功能，故在不同的豬精液稀釋液配方中常添加葡萄糖、果糖或者海藻糖。海藻糖不僅可以作為供能物質(zhì)，也可以作為精子的質(zhì)膜保護(hù)劑和抗氧化劑。高建明等（2007）研究證明在精液稀釋液中添加適量的海藻糖可以提高精子的活率，并降低精子的畸形率。除上述幾種糖外，乳糖也得到了部分應(yīng)用，乳糖作為一種還原性二糖，能夠作為抗氧化劑進(jìn)行使用。商品豬精液稀釋粉分為短效稀釋粉和長(zhǎng)效稀釋粉，除其添加物不同外，添加葡萄糖的比例也存在差異。有研究表明，豬精液保存時(shí)間的長(zhǎng)短與含糖濃度有關(guān)，低糖濃度的稀釋液更有利于精液的保存。王雪晗等（2017）研究表明乳糖較其他糖類可以在豬精液的冷凍保存中更好地保護(hù)精子的質(zhì)膜不受損傷。

5.2 緩沖劑

為了保持精子內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定并防止其代謝產(chǎn)物影響稀釋液的pH，需要在稀釋液中添加緩沖劑。目前常用的緩沖劑主要有Hepes、Tes、Mops、Tris、NaHCO3和檸檬酸鈉等。豬新鮮精液的pH為7.2～7.5，一系列的研究證明，偏酸性的環(huán)境有利于精子的保存。在稀釋液中添加NaHCO3、檸檬酸鈉等緩沖劑有利于平衡精子和細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，維持一個(gè)動(dòng)態(tài)的相對(duì)平衡的酸堿環(huán)境，以防止因保存液的過度酸化而導(dǎo)致精子的活率下降等問題的發(fā)生。當(dāng)精液保存液的pH為5.7～6.4時(shí)，精子的頂體發(fā)生異常的概率會(huì)增加。除上述的緩沖劑外，一般還會(huì)在保存液中添加一些具有金屬螯合能力的兩性緩沖劑，如Hepes等。一些離子對(duì)精子的存活和功能是必需的，較低濃度的K+可維持精子膜上Na+-K+泵運(yùn)轉(zhuǎn)，使胞內(nèi)K+濃度大于胞外，生產(chǎn)ATP維持精子的存活和運(yùn)動(dòng)，因此在稀釋液中添加KCl可防止精子耗盡K+而喪失運(yùn)動(dòng)能力。還有一些離子不利于精子保存，如有緩沖作用的HCO3-，若過量就會(huì)使精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)改變，使質(zhì)膜不穩(wěn)定誘發(fā)獲能，因此需要控制其濃度。Ca2+跨膜流入胞內(nèi)會(huì)啟動(dòng)精子獲能，引起頂體反應(yīng)，這對(duì)完成受精是必需的，但對(duì)保存卻是不利的。因此，配制稀釋液常用去離子水，并加入EDTA等用來鏊合Ca2+和有害重金屬離子。

5.3 抗生素

為了延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間，人們?cè)诰旱南♂屢褐刑砑硬煌N類的抗生素如青霉素、鏈霉素等，一般青霉素鈉的添加量為0.6 g/L，硫酸鏈霉素的添加量為1 g/L。添加抗生素可以殺死或抑制有害細(xì)菌，延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間，提高受精能力。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)。青霉素在稀釋精液中12 h后效價(jià)降低50 %，精子保存時(shí)間和效果均無法達(dá)到理想效果?？梢?，過去常在精液稀釋液中添加的青霉素和鏈霉素已無法有效抑制細(xì)菌微生物生長(zhǎng)繁殖。隨著青霉素在稀釋精液中作用的減弱，不斷有學(xué)者開發(fā)新的抗生素。由于磺胺類抗生素的抗菌譜較廣，毒副作用輕，對(duì)常見細(xì)菌、螺旋體和某些放線菌均能表現(xiàn)出抑制作用，被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)各環(huán)節(jié)。其他種類的抗生素還有恩諾沙星、阿奇霉素、林肯霉素，氨苯磺胺等，但有關(guān)各種抗生素在稀釋精液中的抑菌效果還有待進(jìn)一步研究。

精液保存液中的細(xì)菌會(huì)使稀釋液的pH下降、精子更易發(fā)生凝集、頂體發(fā)生異常的情況，并在保存的第2天就有所表現(xiàn)，從而降低精液的保存時(shí)間。輸精后會(huì)導(dǎo)致母豬的返情率升高，陰道內(nèi)分泌物增多，增加母豬陰道的感染幾率，從而增加母豬的淘汰率。由于抗生素的不正確使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，所以急需研制一種抗生素的替代品，這種替代品不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此抗菌肽進(jìn)入了人們的視線。有研究發(fā)現(xiàn)，在 BTS 保存液添加低濃度的環(huán)狀六肽較使用抗生素的對(duì)照組效果要好，并且將添加低濃度環(huán)狀六肽的精液輸入到母豬的子宮內(nèi)，其受胎率不會(huì)受到影響。發(fā)現(xiàn)這種環(huán)狀六肽可以補(bǔ)充或替換稀釋液中的抗生素。除抗菌肽外，聚維酮碘在豬精液稀釋液上的研究也取得了一定的成果。眾所周知，聚維酮碘作為一種廣譜殺菌劑常被應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中。鄭亞妮等（2015）研究發(fā)現(xiàn)按1∶100稀釋使用的聚維酮碘可以提高精液的保存質(zhì)量，在殺滅稀釋液中大量細(xì)菌的同時(shí)并不會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用。中草藥是中華醫(yī)學(xué)界的瑰寶，中草藥的許多成分對(duì)細(xì)菌有很好的殺滅作用。侯震坤等（2017）研究發(fā)現(xiàn)在常溫保存精液中添加中藥提取物淫羊藿可以取得很好的抑菌效果，同時(shí)減少精子的氧化損傷。謝東淇等（2017）研究發(fā)現(xiàn)常溫精液中添加適量的茶多酚同樣也可以取得較好的抑菌效果。我國(guó)中草藥資源豐富，有很多中草藥抑菌劑已廣泛的應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但其在豬精液抑菌劑上的研究較少。如夏枯草、石榴皮、黃連、白頭翁和烏梅等，這些具有良好抑菌效果的中草藥在豬精液保存方面的有待進(jìn)一步研究。

5.4 抗氧化劑

在精液的常溫保存過程中，精子呼吸代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧族（Reactive oxygen species，ROS），低濃度的ROS有利于提高精子的活力以及受精能力，但高濃度的ROS會(huì)造成精子脂質(zhì)的過氧化（Lipid peroxidation，LOP）， 改 變精子質(zhì)膜的通透性，這會(huì)降低精子活力以及受精能力。在豬精液保存的后期精子活力以及受精能力下降幅度較大，這是因?yàn)榫淤|(zhì)膜上的不飽和脂肪酸不斷氧化，所產(chǎn)生的氧自由基超出了稀釋液中抗氧化物質(zhì)的含量，使精子的膜功能造成了不可逆的損傷。所以常在精液的稀釋液中添加抗氧化劑成分來保證精子的活力以及受精能力。谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一種三肽化合物，可以抑制質(zhì)膜上脂質(zhì)的過氧化。維生素B12、維生素E、維生素C、過氧化氫酶、甲基黃嘌呤、超氧化物歧化酶、半胱氨酸、丁羥甲苯、褪黑激素、大棗多糖和葡萄籽原花青素，也都具有抗氧化的作用。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase from micrococcus hemolyticus，CAT）是目前在豬精子保存中最常用到的且最重要的兩種清除氧自由基的酶。任俊玲等（2012）研究表明，在豬冷凍精液稀釋液中同時(shí)添加100 IU/mL SOD 和200 IU/mL CAT 可以明顯增強(qiáng)解凍后精子保存效果。有研究表明，在豬的精液稀釋液中添加1 mmol/L的谷胱甘肽對(duì)精液有較好的保護(hù)效果，而添加1 mmol/L和5 mmol/L 的維生素E對(duì)精液常溫保存效果有害。而添加400 μmol/L的維生素E可以顯著降低保存4 d精液中丙二醛（ MDA）的含量。在豬精液的稀釋液中添加適量的褪黑素可以提高精液的抗氧化能力和精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)，保護(hù)精子質(zhì)膜、頂體和 DNA完整性，提高精子的受精能力。海藻糖可以在精子的細(xì)胞膜外形成一層保護(hù)膜，從而保護(hù)質(zhì)膜被氧化。同時(shí)，海藻糖還具有穩(wěn)定細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的作用。胡建宏等（2006）研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在極冷環(huán)境下可以保護(hù)精子的質(zhì)膜，在常溫下對(duì)精子的質(zhì)膜同樣能起到保護(hù)作用，該配方通過添加1 g/L海藻糖，使保存7 d精液的頂體異常率由原來的20%下降到11%。高建明等（2016）在自己設(shè)計(jì)篩選的100 mL稀釋液中額外添加0.15 g海藻糖，顯著提高了精液的保存時(shí)間，其保存效果要優(yōu)于添加維生素B12組[37]。精子長(zhǎng)效稀釋液中添加GSH 可以有效降低精子代謝活性以及保護(hù)精子質(zhì)膜完整性。

5.5 其他保護(hù)成分

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）是一種蛋白類保護(hù)劑，具有穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)、中和精子有害代謝產(chǎn)物、維持精子運(yùn)動(dòng)及減少精子凝集等多種功能，從而起到延長(zhǎng)精液保存時(shí)間、提高保存后精液的受精能力的作用。在精液稀釋液中添加4 mg/mL的BSA，其精液的保存效果最好。但 BSA 在較高濃度下會(huì)導(dǎo)致精子的獲能，所以添加時(shí)要控制其用量。

中草藥作為我國(guó)醫(yī)藥的瑰寶在豬精液的保存方面也有一定的應(yīng)用。范曉騰等（2016）發(fā)現(xiàn)在豬精子常溫保存和降溫過程中白藜蘆醇對(duì)精子具有一定的保護(hù)作用，能夠清除豬精子內(nèi)的活性氧自由基，減弱氧自由基對(duì)精子的損傷，提高精子的品質(zhì)。在常溫保存中最佳保護(hù)濃度為50 μmol/L。芝麻酚作為一種新型的抗氧化劑可以提高精子的抗氧化能力，提高冷凍后精子的DNA完整率。茶多酚是茶葉中的主要成分之一，其具有較好的抗氧化能力。謝東淇等（2017）研究發(fā)現(xiàn)在豬精液中添加0.04 g/L的茶多酚（Tea's polyphenol，TPP）不僅可以提高豬精液的保存質(zhì)量，同時(shí)也可以降低精液中的細(xì)菌含量。此外，茶多酚還可以與殼聚糖聯(lián)合使用對(duì)精液中的大腸桿菌起到殺滅的作用，同時(shí)也可以提高精子的抗氧化能力。但由于許多中草藥的成分并不明確，以及添加劑量可能隨草藥產(chǎn)地的不同而不同，所以具體的應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究。但隨著科技的發(fā)展以及中草藥低溫萃取技術(shù)的不斷完善，相信在不久的將來中草藥將發(fā)揮越來越重要的作用。

綜上所述，通過對(duì)豬精液常溫保存的原理、影響豬精液保存的物理因素、微生物因素、精液稀釋方法以及精液稀釋液成分等研究現(xiàn)狀的分析，對(duì)提高豬精液常溫保存的質(zhì)量和延長(zhǎng)保存時(shí)間提供技術(shù)支持，可為將來豬精液低溫保存，乃至冷凍精液保存技術(shù)的發(fā)展和完善提供參考和幫助。

（ 參考文獻(xiàn)略，如有需要請(qǐng)與作者聯(lián)系。）