吳國(guó)美，張秀玲，高詩(shī)涵，劉明華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

藍(lán)靛果是一種可食用的野生漿果，果實(shí)柔軟多汁、風(fēng)味獨(dú)特，且有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。藍(lán)靛果含有花色苷、黃酮類化合物、多酚和大量的維生素等[2]。研究表明，藍(lán)靛果果實(shí)中的有機(jī)酸、碳水化合物含量分別以檸檬酸、葡萄糖最多，并含有16種氨基酸等[3]。藍(lán)靛果具有較強(qiáng)的抗氧化作用，還有降血脂、抗肥胖、抗脂肪肝、抗輻射和抗癌等作用[4-5]。在抵抗疾病和保持身體健康等方面有重要的作用，有較好的發(fā)展前景[6]。

藍(lán)靛果的采收集中，貯藏期短，果實(shí)采收后容易出現(xiàn)組織軟化、腐敗變質(zhì)等問(wèn)題，所以鮮食只占市場(chǎng)的一小部分，更多的是被用于制作各種加工品[7-8]。各種小漿果的飲品就是以漿果汁為主要原料生產(chǎn)的[9]。因此，對(duì)藍(lán)靛果果汁提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于提高藍(lán)靛果的利用率和價(jià)值至關(guān)重要。酶處理有助于促進(jìn)細(xì)胞壁中纖維素水解和果膠解聚，提高出汁率[10-12]。

目前，關(guān)于藍(lán)靛果的研究報(bào)道有很多，大多都是關(guān)于栽培，針對(duì)藍(lán)靛果的高值化加工方面研究還不多。本試驗(yàn)以藍(lán)靛果作為研究對(duì)象，利用所選擇的果膠酶和纖維素酶對(duì)藍(lán)靛果的出汁率進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，研究這些酶對(duì)藍(lán)靛果果汁中的生物活性物質(zhì)（總酚、花色苷、總黃酮等）含量的影響，并對(duì)藍(lán)靛果果汁的抗氧化特性進(jìn)行研究，為企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果：采自小興安嶺伊春地區(qū)的鮮果，挑選無(wú)損傷鮮果并在-20℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；果膠酶（107000U/g）、纖維素酶（101 900 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；1，10-菲啰啉（1，10-phenanthroline monohydrate，BP）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林-酚試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[（2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiaoline-6-sulphonic acid），ABTS]：美國(guó) Sigma 公司；其他常見(jiàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-1）：常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；多功能打漿機(jī)（MJ-WJS1222F）：美的集團(tuán)股份有限公司；電子天平（FA1004）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（HR/T20M）：湖南赫西儀器裝備有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)靛果的酶解工藝

取適量的藍(lán)靛果于室溫（20℃）下解凍，用打漿機(jī)破碎成勻漿，準(zhǔn)確稱取20 g的藍(lán)靛果漿加入錐形瓶中，再加入一定量的果膠酶和纖維素酶，攪拌均勻，然后將其放入一定溫度的水浴鍋中酶解一定時(shí)間，酶解后5 000 r/min離心15 min，得到藍(lán)靛果的清汁。

1.3.2 酶解優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 g藍(lán)靛果漿，初步選定果膠酶添加量為0.2%，纖維素酶添加量為0.6%，酶解時(shí)間為1.5 h，酶解溫度50℃為基礎(chǔ)條件，以出汁率為指標(biāo)，依次研究果膠酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、纖維素酶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、酶解時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）、酶解溫度（30、40、50、60、70℃）的條件下，各因素對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，以藍(lán)靛果的出汁率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)的工藝條件。酶解響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 酶解響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table1 Enzymatic response surface test factors and levels

1.3.2.3 出汁率的測(cè)定

取經(jīng)酶解后的藍(lán)靛果漿20 g于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定上清液的質(zhì)量，依據(jù)公式計(jì)算出汁率[13]。

1.3.3 活性物質(zhì)及抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 生物活性物質(zhì)含量的測(cè)定

VC含量的測(cè)定采用分光光度計(jì)法[14]；花色苷含量的測(cè)定參照王純等[15]的pH示差法測(cè)定；總酚含量的測(cè)定參照王琴等[16]方法測(cè)定；總黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[17]。

1.3.3.2 體外抗氧化活性的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照H.Liang等[18]方法測(cè)定；羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定參照張麗媛等[19]方法測(cè)定；ABTS+·清除能力的測(cè)定根據(jù)ZHANG Nai-xun 等[20]和 Helena 等[21]方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 果膠酶添加量對(duì)出汁率的影響

果膠酶常應(yīng)用于果蔬，可以有效地提高果蔬的出汁率，保證產(chǎn)品貯存穩(wěn)定性和改善其過(guò)濾速度等[22]。果膠酶添加量對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 果膠酶添加量對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響Fig.1 Effect of pectinase addition on lonicera edulis juice yield

由圖1所示，以不添加果膠酶的樣品為對(duì)照，藍(lán)靛果的出汁率隨著果膠酶的增加先快速增大后變得平緩。因?yàn)榈孜餄舛纫欢〞r(shí)，果膠酶添加量越大，底物和酶的反應(yīng)會(huì)越完全，藍(lán)靛果的出汁率會(huì)越高。當(dāng)果膠酶添加量增加到一定量，反應(yīng)就會(huì)飽和，出汁率就增加不明顯。當(dāng)果膠酶添加量超過(guò)0.3%后，藍(lán)靛果的出汁率增加趨勢(shì)較為緩慢，維持在76%左右。使用大量的果膠酶會(huì)造成浪費(fèi)和影響藍(lán)靛果汁的口味等。因此，選擇果膠酶的添加量在0.2%～0.3%。

2.1.2 纖維素酶添加量對(duì)出汁率的影響

纖維素酶可降解漿果中的纖維素、半纖維素、果膠等，從而提高出汁率[23]。纖維素酶添加量對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在纖維素酶酶解過(guò)程中，以不添加纖維素酶的樣品為對(duì)照，增加纖維素酶的添加量，出汁率會(huì)不斷增大。藍(lán)靛果在纖維素酶添加量達(dá)到1.0%時(shí)，出汁率達(dá)到了77.18%，與對(duì)照相比出汁率提高了8.87%。繼續(xù)增加纖維素酶的用量，藍(lán)靛果的出汁率增加不明顯。因?yàn)檫^(guò)量的纖維素酶不能與足夠的底物相互反應(yīng)，所以出汁率就會(huì)增加不明顯。因此，選擇纖維素酶的添加量為0.8%～1.0%。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)出汁率的影響

圖2 纖維素酶添加量對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響Fig.2 Effect of cellulase addition on lonicera edulis juice yield

酶會(huì)對(duì)植物的細(xì)胞壁進(jìn)行水解，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，從而增加出汁率。酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on juice yield of lonicera edulis

由圖3可以看出，以0.5 h為對(duì)照，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，出汁率越高。藍(lán)靛果的出汁率在0.5 h～1.5 h內(nèi)漲幅較快，當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，出汁率達(dá)到了72.83%。酶解時(shí)間超過(guò)1.5 h后，出汁率的增加變得緩慢。因?yàn)樵谝欢ǖ姆磻?yīng)時(shí)間內(nèi)，酶和底物就會(huì)反應(yīng)完全，再增加反應(yīng)的時(shí)間，對(duì)藍(lán)靛果的出汁率影響不大。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為1.5 h。

2.1.4 酶解溫度對(duì)出汁率的影響

酶解溫度對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，以常溫20℃為對(duì)照，酶解溫度在20℃～50℃范圍內(nèi)時(shí)，藍(lán)靛果的出汁率隨酶解溫度的升高而增大。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，藍(lán)靛果的出汁率達(dá)到最大值73.83%。隨后再增加溫度，藍(lán)靛果的出汁率降低。這是因?yàn)?，酶要在一定溫度范圍?nèi)才能發(fā)揮其活性的作用，酶解溫度過(guò)低，底物與酶不能有效的反應(yīng)，過(guò)高的溫度則會(huì)使酶失活[24]。在酶解過(guò)程中，選擇40℃～50℃作為酶解的最適溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on juice yield of lonicera edulis

2.2 酶解優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，酶解時(shí)間超過(guò)1.5 h后藍(lán)靛果出汁率增長(zhǎng)較小，為節(jié)約成本和時(shí)間，選定果膠酶添加量（A）、纖維素酶添加量（B）和酶解溫度（C）3個(gè)因素進(jìn)行Box－Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到最佳的酶解優(yōu)化條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken design and results

2.2.2 方差分析及互交作用

用Design－Expert 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到回歸方程為：藍(lán)靛果的出汁率/%＝84.75+0.79A+0.39B+0.40C+1.89AB+0.32AC+0.087BC-1.89A2-2.66B2-0.94C2?；貧w模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

從表3中可以看出，回歸模型的顯著性很高（P＝0.000 4＜0.01），缺乏擬合用于驗(yàn)證模型的充分性且不顯著（P＝0.462 5>0.05），表明該模型的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，R2＝0.961 5接近1，表明此模型擬合較好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)酶解的藍(lán)靛果出汁率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)F值可知，各個(gè)因素對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響大小順序?yàn)椋汗z酶（A）>酶解溫度（C）>纖維素酶（B）。

響應(yīng)曲面圖和等高線圖是回歸方程的圖形化表示，說(shuō)明獨(dú)立變量對(duì)響應(yīng)變量的主要交互作用[25]。各因素交互作用對(duì)藍(lán)靛果出汁率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5顯示了藍(lán)靛果出汁率與各因素之間的關(guān)系，由圖5a可以看出，隨著酶用量的增加，藍(lán)靛果出汁率先增加后減少，且果膠酶對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響要大于纖維素酶；由圖5b可以看出，果膠酶對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響要遠(yuǎn)大于酶解溫度；由圖5c可以看出，酶解溫度和纖維素酶用量對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響不明顯，且酶解溫度對(duì)藍(lán)靛果出汁率的影響要大于纖維素酶。這與表3中方差分析的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)藍(lán)靛果出汁率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour map and response surface diagram of the interaction of various factors on juice yield of lonicera edulis

2.2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面的回歸模型，確定藍(lán)靛果出汁率的最佳條件為：果膠酶添加量0.27%、纖維素酶添加量0.92%、酶解溫度46.40℃，此時(shí)預(yù)測(cè)的藍(lán)靛果的出汁率為86.98%。為便于實(shí)際操作，選擇果膠酶添加量為0.27%、纖維素酶添加量為0.92%、酶解溫度為47℃。在這個(gè)工藝條件下，得到藍(lán)靛果的出汁率為85.67%，與預(yù)測(cè)值的差異為1.31%，表明此回歸模型可以較好地預(yù)測(cè)藍(lán)靛果的出汁率。

2.3 酶解對(duì)藍(lán)靛果汁品質(zhì)的影響

采用優(yōu)化后的最佳酶解工藝對(duì)藍(lán)靛果進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解后藍(lán)靛果汁中各活性物質(zhì)的含量，對(duì)照組為自然解凍下未加酶的藍(lán)靛果汁。酶解前后藍(lán)靛果汁中活性物質(zhì)含量的變化結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，復(fù)合酶解后，藍(lán)靛果汁中的活性物質(zhì)含量都有一定的增加。復(fù)合酶解后，藍(lán)靛果汁中的活性物質(zhì)含量與對(duì)照組相比有顯著增加，VC含量可達(dá)5.11 mg/mL、花色苷含量為3.13 mg/mL、總酚含量為3.11 mg/mL、總黃酮含量達(dá)到6.97 mg/mL。通過(guò)對(duì)比單一酶解和復(fù)合酶解后藍(lán)靛果汁中活性物質(zhì)含量，可以得出，復(fù)合酶解工藝有利于藍(lán)靛果汁中活性物質(zhì)的溶出。

圖6 酶解前后藍(lán)靛果汁中活性物質(zhì)含量的變化Fig.6 Changes of active substances in lonicera edulis juice before and after enzymolysis

2.4 藍(lán)靛果汁體外抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力

藍(lán)靛果汁對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 藍(lán)靛果汁對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.7 Scavenging activity of lonicera edulis juice on DPPH free radical

由圖7可知，酶解前后的藍(lán)靛果汁和VC對(duì)照組對(duì)DPPH自由基能較好地清除，在所選的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。酶解前后的藍(lán)靛果汁對(duì)自由基的清除活性有一定差異，VC的清除能力要優(yōu)于藍(lán)靛果汁，藍(lán)靛果汁的清除能力酶解后要優(yōu)于酶解前，酶解前后的IC50值分別為0.551 mg/mL和0.285 mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL時(shí)，酶解前后的藍(lán)靛果汁對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)80.56%和88.13%。

2.4.2 ·OH清除能力

·OH是最活潑的活性氧自由基，是有毒的氧化代謝副產(chǎn)物，可以改變細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)等[26]。藍(lán)靛果汁對(duì)·OH的清除能力見(jiàn)圖8。

圖8 藍(lán)靛果汁對(duì)·OH的清除能力Fig.8 Scavenging activity of lonicera edulis juice on·OH

由圖8可知，以VC為對(duì)照，酶解前后的藍(lán)靛果汁對(duì)·OH的清除率隨質(zhì)量濃度增加而增大，且清除率均低于VC。酶解前后的IC50值分別為8.66 mg/mL和6.37 mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，酶解前后的藍(lán)靛果汁對(duì)·OH的清除率可達(dá)61.40%和74.12%。藍(lán)靛果汁對(duì)·OH有較好的清除作用。

2.4.3 ABTS+·清除能力

藍(lán)靛果汁對(duì)ABTS+自由基的清除能力見(jiàn)圖9。

圖9 藍(lán)靛果汁對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.9 Scavenging activity of lonicera edulis juice on ABTS+free radical

由圖9可以看出，VC和酶解前后的藍(lán)靛果汁對(duì)ABTS+·的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而增大，藍(lán)靛果汁有較強(qiáng)的清除能力，且低于VC。酶解前的藍(lán)靛果汁在質(zhì)量濃度為60 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率可達(dá)92.90%。酶解后的藍(lán)靛果汁對(duì)ABTS+·的清除能力要優(yōu)于酶解前，酶解后的藍(lán)靛果汁在質(zhì)量濃度為40mg/mL時(shí)，ABTS+·的清除能力基本達(dá)到平衡，清除率高達(dá)94%左右。酶解前后的IC50值分別為17.15 mg/mL和11.62 mg/mL。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)藍(lán)靛果的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。得到的最佳條件為：果膠酶添加量0.27%、纖維素酶添加量0.92%、酶解溫度為47℃。在此工藝條件下，藍(lán)靛果的出汁率為85.67%。酶解對(duì)藍(lán)靛果汁中的VC、花色苷、總酚和總黃酮都有積極的影響，其中對(duì)VC含量和總黃酮含量的影響較為顯著。通過(guò)對(duì)DPPH·、·OH、ABTS+·的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)藍(lán)靛果汁的抗氧化活性，酶解對(duì)藍(lán)靛果汁的抗氧化能力有顯著提升，IC50值減小。酶解后的藍(lán)靛果汁具有較高的清除率，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL時(shí)，藍(lán)靛果汁對(duì)DPPH自由基的清除率為88.13%；當(dāng)質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，藍(lán)靛果汁對(duì)·OH的清除率為74.12%；藍(lán)靛果汁在質(zhì)量濃度為60mg/mL時(shí)，ABTS+·的清除率達(dá)到最大為94.67%。利用酶解法提高藍(lán)靛果的出汁率，增加其生物活性物質(zhì)的溶出，提高其抗氧化活性，這有利于藍(lán)靛果高值化研究和功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。