miRNA 調控家畜肌肉組織生長發(fā)育的研究進展

馮紫婷 ，安清明，王大會，賀 花，李心語，文逸凡，雷初朝，陳 宏，黃永震*

（1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.銅仁學院農林工程與規(guī)劃學院，貴州銅仁 554300；3.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100）

miRNA（microRNA）作為一類對生物體具有調控功能的非編碼小分子RNA，在動植物細胞中均可廣泛表達。經研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 能夠抑制其靶mRNA 的表達并進而調控動物相應的生理生化水平，因此認為它對動物機體具有重要的調節(jié)作用[1]。肌肉組織正常的生長發(fā)育是動物優(yōu)良的生產價值和產品品質的保障。肌肉組織的生長在家畜胎兒時期主要依靠于肌纖維的增殖和分化，出生后憑借肌細胞體積的增大來維持一定水平的肌纖維數(shù)目[2]，而miRNA 的表達正是影響肌細胞生長發(fā)育過程的重要調控因素。miRNA 在肌肉組織中的表達可以分為肌肉特異性和非肌肉特異性?？茖W家把在肌肉中能夠特異性表達的miRNA 歸為myomi Rs 家族[3]，如miRNA-206、miRNA-133、miRNA-1 等均為肌肉特異性miRNA；miRNA-23a、miRNA-24 等不在肌肉組織中特異性表達，但它們對于家畜肌肉組織的作用也不容小覷[4]。本文對miRNA 在不同家畜肌肉細胞中的作用和調控機制做一論述，并對其在生產運用上的發(fā)展進行展望。

1 miRNA 研究背景及作用機制

歷史上首個miRNA 是Lee 等[5]在線蟲體內發(fā)現(xiàn)的，這種僅有22 個核苷酸的小分子RNA 可以通過與lin-4基因的3'UTR 堿基互補配對來抑制該基因的表達，從而致使相關蛋白質的合成減少；2000 年，let-7作為人類發(fā)現(xiàn)的第2 個miRNA 引發(fā)了研究者的關注[6]，let-7相似于lin-4，同樣可以調節(jié)線蟲的發(fā)育進程。自此，miRNA 調控機制的研究逐漸引起人們重視，且相繼在線蟲、果蠅、人類、小鼠、豬等物種中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的miRNA 基因。

隨著研究的不斷深入，miRNA 的形成機制也逐漸明朗：miRNA 最初是由miRNA 基因首先轉錄為一較大的前體pri-miRNA，然后再經RNase Ⅲ核酸酶的Drosha[7]和其他蛋白復合體將pri-miRNA 剪切為具有70 nt 的莖環(huán)發(fā)夾結構的pre-miRNA 形式，隨后premiRNA 從細胞核轉運進入胞質，再進一步被Dicer 酶裂解生成具有22 nt 的雙鏈小分子，最后將其互補配對序列解鏈，形成最終產物miRNA。通過科學家不斷的探究發(fā)現(xiàn)，miRNA 是通過由siRNA 與Argonaute 蛋白和Dicer 酶復合形成的RNA 誘導基因沉默復合物（RISC）的激活來抑制基因表達，其具有等調控模式[7]。在不同條件下，不同的miRNA 通過與之對應的Argonaute 蛋白組成miRISC，然后作用于其靶mRNA，進而調控基因的表達和蛋白的產生[7]。然而，也有研究者發(fā)現(xiàn)，miRNA 實際上是一類對基因表達量一般僅具有微調作用的RNA 分子，如Bartel 等[9]將miRNA 比作物理上的微型電阻，miRNA 根據自身與其靶基因的配對水平，發(fā)揮著從100% 抑制到微弱抑制的生物學效應，而在miRNA 家族中具有明顯影響效應的（如lin-4、let-7）實際為數(shù)較少，更多起著微調的作用。

2 肌肉的形成機制

肌肉細胞主要是由胚胎時期的軸旁中胚層和側中胚層分化而來，其中所有的骨骼肌都來自于軸旁中胚層的生肌節(jié)區(qū)，所有心肌和平滑肌都來自于側中胚層。隨著肌肉組織的不斷發(fā)育，骨骼肌間質細胞從具有DNA 復制和細胞分裂的單核細胞逐漸分化為不具有復制能力的成肌細胞，之后肌細胞之間進一步發(fā)生融合形成肌管，隨著肌細胞核從細胞中心向細胞邊緣的移動以及肌原纖維數(shù)目的不斷增加，最終肌管將成為肌纖維來作為肌肉組織生長發(fā)育的基本組成物質。在肌管階段，還有部分單核細胞會分化為肌衛(wèi)星細胞，用于肌肉損傷時的再生肌細胞。動物肌肉的生長發(fā)育過程主要依賴肌纖維的增殖、分化和凋亡功能來完成肌肉組織的形成。而肌纖維的生長又可分為出生前和出生后2 個時期：出生前動物肌肉的形成主要依靠肌細胞的增殖和細胞體積的擴大；出生后動物的肌纖維數(shù)目維持一定的水平基本保持不變，主要依靠肌細胞體積的增大和肌細胞的凋亡[10]來維持肌肉正常的生長發(fā)育。

3 miRNA 對家畜肌肉發(fā)育的調控

3.1 miRNA 對牛肌肉組織的調控 對于肉牛而言，肌肉組織的生長發(fā)育作為影響產肉量和牛肉品質的直接因素，一直是牛分子育種上的研究熱點。miRNA 作為影響其生長發(fā)育的重要因素之一也逐漸走入研究者的視野。眾所周知，閹公牛的肉質多汁、鮮美，其食用口感顯著優(yōu)于正常公牛，在市場上廣受好評，因此探究造成這種差異的分子機制也成為了科學家的研究方向。夏廣軍[11]利用全基因組芯片和miRNA 芯片技術構建了公牛和去勢公牛背最長肌差異表達基因庫，并篩選出背最長肌中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)在被檢測到的3 769 個miRNA 中有32 個存在差異表達，且其中有26 個miRNA 可關聯(lián)到12 個差異表達的靶基因上，進一步佐證了miRNA 對肌肉組織發(fā)育具有調控作用；實驗還利用GO 分析發(fā)現(xiàn)了多個基因及信號通路參與各種生物學過程及細胞組成等，但其具體作用機制還尚待考究。牛的生長主要可以分為胚胎期、哺乳期、幼年期、青年期以及成年期，不同生長時期的肌肉增長速度和方式也固然不同。孫加節(jié)[12]利用R 包edgeR 對755 個秦川牛出生前后共5 個時期的背部肌肉中miRNA 的表達情況進行了鑒定，結果顯示miRNA 在5 個時期均有較高水平表達，但miRNA 在出生前表達種類豐富而出生后表達相對集中，說明miRNA 在肌肉組織中的表達具有時空特異性；研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-10020 與miRNA-133 作用機制相似，可直接通過調控靶基因ANGPT1的表達水平從而抑制出生后肌衛(wèi)星細胞的分化，維持肌纖維數(shù)目的恒定，但敲低miRNA-10020 的表達量對牛肌衛(wèi)星細胞并未產生顯著影響。這其中的原因及分子機制還需要進一步探索。CircRNA 作為一種分子海綿，可與miRNA 結合并調節(jié)其分子功能。魏雪鋒[13]以秦川牛為實驗對象，利用超表達及干擾手段，以高通量測序方法建立了circRNA-miRNA-mRNA 作用網絡，結果發(fā)現(xiàn)circMLO7 可與miRNA-378a-3p 靶向結合并抑制其活性，解除它對HDAC4基因的抑制作用。HDAC4基因不僅可以通過基因轉錄的表觀遺傳調控，以細胞自主的方式促進衛(wèi)星細胞的補充和分化，還能通過肌肉衍生可溶性因子影響肌源性細胞的生長，從而促進肌細胞的增殖，抑制肌細胞的分化[14]。并且miRNA-378a-3p在肌肉組織中表達量與其他類miRNA 相比具有顯著優(yōu)勢，它的高表達量一方面可以下調細胞凋亡抑制因子的表達水平，上調凋亡誘導因子的表達水平，促進肌細胞的凋亡；另一方面又會上調肌肉分化因子的表達水平，起到促使肌管合成和肌細胞分化的作用。除此之外，該研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-107 的生物學效應恰恰與miRNA-378a-3p 相反，高表達量的miRNA-107 可利用其靶基因Wnt3a來抑制肌細胞分化、促進肌細胞增殖[13]，這也可能成為今后牛的育種工作上新的分子標記方式。Tomasz 等[15]研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在骨骼肌細胞中的表達情況還與品種有關，它們對海福特牛（HER）和利姆豪斯牛（LIM）的半腱肌進行肌源性分化，最終在兩者的骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)了4 個差異表達的myomiRs，且其在HER/LIM 原代培養(yǎng)物中的表達量顯著高于對照組；細胞培養(yǎng)結果還顯示miRNA-1 和miRNA-206 會促進肌肉的分化，而miRNA-133 則主要促進肌肉細胞的增殖，這也驗證了Dai 等[16]發(fā)現(xiàn)miRNA-1 和miRNA-206 通過下調PAX7和HDAC4調控骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化的機制。

3.2 miRNA對羊肌肉組織的調控 miRNA-431、miRNA-433、miRNA-127、miRNA-434、miRNA-432 以及miRNA-136是首次在雙肌臀羊肌肉細胞中被鑒定出來的幾種miRNAs，這些成熟體的發(fā)現(xiàn)表明了miRNA 對羊的肌肉性狀具有不可忽視的調控作用。miRNA-1 與miRNA-133 作為2 種最常見的調控肌肉組織生長發(fā)育的miRNA，其調控作用已在不同動物中被逐漸證實。王麗娟[17]對安徽白山羊和波爾山羊10 個不同組織中miRNA-1 和miRNA-133 的表達規(guī)律進行了研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-1 和miRNA-133 可通過抑制其靶基因HDAC4和SRF的翻譯即抑制其轉錄后表達來降低HDAC4 和SRF 蛋白的表達，從而調節(jié)骨骼肌細胞的發(fā)育狀態(tài)。此外，宋廣超[18]檢測miRNA-133 在4 個不同綿羊品種中的表達多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其前體物中存在GG 基因型可顯著提高miRNA-133 的表達水平，即可促進骨骼肌細胞的增殖，可以通過基因突變來調控肌肉發(fā)育情況。近些年，肌細胞的生長發(fā)育具有時空特異性這一現(xiàn)象也逐漸在各種羊的肌肉組織中被證實。王艷紅[19]對徐淮山羊90 d 的羔羊和6 個月齡成年羊肌肉組織的小RNA 庫進行了測序，發(fā)現(xiàn)二者肌肉組織中的小RNA 組成差異顯著，即存在時空特異性，但實驗并未詳細說明這其中miRNA 所占的比例及差異情況，所以無法有力驗證miRNA 在該山羊肌肉組織中是否存在時空特異性；實驗通過對相應的轉錄組譜進行整合分析，在2 個發(fā)育階段肌肉組織中篩選出了12 個對肌肉發(fā)育可能具備重要作用的miRNA，其中miRNA-424-5p 被發(fā)現(xiàn)對C2C12細胞（成肌細胞）具有促進分化的作用。楊靈芝[20]以湖羊為研究對象，不僅驗證了miRNA 在其肌肉組織中表達的時空特異性，還發(fā)現(xiàn)在胸肌組織中具有高表達量的miRNA-452 可以通過靶基因ANGPT1來促進成肌細胞的增殖并抑制其分化，這為湖羊的品種改良提供了新思路和新方法。為進一步探尋不同羊品種miRNA 表達的時空特異性，張偉等[21]利用Solexa 測序技術檢測到了有385 個miRNA 在巴什拜羊出生前后具有上調或下調的差異表達，可以推測這些miRNA 對巴什拜羊肌肉的發(fā)育狀態(tài)和品質可能存在著重要的調控機制，其中也不排除miRNA-1、miRNA-133 和miRNA-206 等在骨骼肌各個生長階段都具備重要調控作用，這些miRNA在出生前后的表達量變化小，維持著相對穩(wěn)定的表達水平，對綿羊肌肉組織的發(fā)育同樣具有重要意義。

3.3 miRNA 對豬肌肉組織的調控 經研究者發(fā)現(xiàn)，豬肌肉細胞的miRNA-133 和miRNA-1 位于同一條染色體上，且在心肌和骨骼肌細胞中都具有表達特異性[22]，其中miRNA-1 可以促進豬肌肉的分化成熟且抑制其增殖，而miRNA-133 與其作用完全相反，二者相輔相成共同調節(jié)肌肉的生長。為了揭示miRNA 在不同品種豬肌肉組織中的表達差異情況，Tang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肌特異性miRNA-133b 和miRNA-206 在長白豬、通城豬和五指山豬產前骨骼肌中的表達模式不同，表達量達到峰值的時期也存在較大差異，表明相同miRNA 在不同豬品種中會發(fā)揮出不同的表達方式及調控機制。Zhu 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-199b 對長白豬的肌衛(wèi)星細胞的增殖具有抑制作用，而其靶基因JAG1對豬肌纖維細胞的增殖具有促進作用，所以miRNA-199b 的調控機制是通過對JAG1基因的負調控來對豬肌衛(wèi)星細胞發(fā)揮作用；實驗還發(fā)現(xiàn)當JAG1基因過表達時會促進miRNA-199b的產生，即其過程具有負反饋作用，推測這可能是為了維持豬肌衛(wèi)星細胞增殖水平的穩(wěn)定，避免增殖過度情況的發(fā)生，但具體機制還有待對JAG1 上調miRNA-199b表達做進一步研究。梅山豬的體重一般均低于野生型梅山豬，Xie 等[25]通過對肌生長抑制素（MSTN）功能缺失的梅山豬（MKO）和野生型梅山豬（MWT）進行生物學測序，發(fā)現(xiàn)MKO 與MWT 相比有4 個miRNA 顯著上調，5 個miRNA 顯著下調，且GO 分析顯示這些miRNA 的靶基因在肌肉生長、肌纖維形成等生物學過程上富集，表明這些miRNA 可能直接參與豬骨骼肌細胞的分化和肥大，從而造成了體重增加，但其具體作用機理還尚不清楚，仍需后續(xù)進行相關研究對此進行驗證。

4 應用與展望

miRNA 作為動物體內重要的調控分子之一而備受研究者關注。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNA 被發(fā)現(xiàn)在家畜肌肉組織中差異表達，它通過與相應的靶基因結合，經過Wnt 等信號通路來促進或抑制肌細胞的增殖、分化以及凋亡等生命過程。因此，探究miRNA 對肌肉的正確調控機制對肉制品的改良和畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。然而截至目前為止，關于miRNA 對其靶基因以及生物學效應的具體作用機制還處于不明確的狀態(tài)，miRNA 對家畜肌肉組織的調控具有時空差異性的原因也尚未揭曉。隨著科學技術發(fā)展及科研深入，利用miRNA 的調控作用來提高家畜的產肉量和肉品質，將為我國畜牧生產的發(fā)展提供新思路和新方法。