程秋如 劉子凡 曾憲海 曾 精

(1 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院 海南?？?570228;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州油棕種質(zhì)資源圃 海南海口 571101)

油棕（Elaeis guineensisJacq.）屬棕櫚科油棕屬，通常有兩個種，即非洲油棕（E.guineensis）和美洲油棕（E.oleifera） ，其中非洲油棕是世界上生產(chǎn)效率最高的油料作物，年均產(chǎn)油量達4.27 t/hm2，被美譽為“世界油王”，廣泛栽培于南緯10°至北緯15°的熱帶亞非拉國家和地區(qū)。油棕生產(chǎn)期短，一般植后2～3 年開花結(jié)果，經(jīng)濟壽命長達25～30 年，具有單產(chǎn)高、早結(jié)果、易撫管、品質(zhì)好和用途廣等優(yōu)點。油棕具備承載“食用油安全保障戰(zhàn)略、化石能源有益補充”的重要作用，被廣泛應(yīng)用于食品、化工、生物柴油等領(lǐng)域［1］。

前期調(diào)查表明，我國熱區(qū)海南、云南、廣東、廣西、福建5省區(qū)均有引種油棕［2］，但冬季低溫降至5～8℃，持續(xù)時間達數(shù)天，會對油棕生長和結(jié)果產(chǎn)生較大影響［3］，威脅著我國油棕產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，開展油棕抗寒性研究對發(fā)展我國熱帶北緣油棕產(chǎn)業(yè)具有現(xiàn)實意義。目前油棕的抗寒性研究取得了一些進展，相關(guān)研究成果對培育抗寒高產(chǎn)油棕新品種、發(fā)展配套豐產(chǎn)栽培技術(shù)以及抗寒分子育種技術(shù)等具有重要推動作用。

1 溫度對油棕生長發(fā)育的影響

1.1 低溫

低溫是作物生長過程中重要的非生物脅迫因子。我國熱區(qū)地處熱帶北緣，熱量比其他油棕主產(chǎn)區(qū)都低，并經(jīng)常遭遇低溫侵襲，尤其是極端低溫，對我國油棕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成嚴重威脅。油棕適宜生長的年平均氣溫為25～28℃，氣溫在22℃以上時能正常開花結(jié)果，當氣溫低于15℃時油棕停止生長，而低于10℃時，則導(dǎo)致葉片枯爛， 未展心葉畸形生長，花器發(fā)育受阻。研究表明，極端最低氣溫對油棕生長發(fā)育影響最大，當氣溫降至3℃時，葉片出現(xiàn)嚴重凍壞，果穗敗壞嚴重，個別成齡樹凍死，并出現(xiàn)大量減產(chǎn)［4］。我國自1926年多次引種，經(jīng)過長期自然引種馴化，抗寒力已提高，并逐漸適應(yīng)了我國熱區(qū)的氣候條件。2008年初中國南方遭受了80 年一遇的持續(xù)寒害天氣，期間海南島氣溫比往年偏低5～8℃，曹建華等［3］對海南12 個油棕新品種的抗逆性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，冷害期間油棕無植株死亡，少數(shù)葉片受冷害，幼果幾乎全部受害，當年油棕減產(chǎn)約20%，但冷害過后所有油棕都能正常開花結(jié)果。2003 年11 月從馬來西亞引進800粒油棕優(yōu)良品種在西雙版納進行引種試種，3 年后可正常開花，在2008 年最低氣溫降至8～9℃，且持續(xù)兩天，對油棕的生長無任何影響［5］。

受全球氣候變暖影響，Sarkar 等［6］預(yù)測到2100 年全球氣溫將上升1～4℃，溫度高于最適油棕生長溫度將可能導(dǎo)致減產(chǎn)，從而減少了全球適宜油棕種植的區(qū)域，但同時適宜種植油棕的區(qū)域?qū)⑾蚰媳眱蓸O移動，目前的亞熱帶地區(qū)，可能會變的有利于油棕生長。

1.2 有效積溫

有效積溫是一個地區(qū)固定的熱量資源，是影響作物生長發(fā)育的重要因素之一。油棕主產(chǎn)國馬來西亞日平均溫度≥22℃的年有效積溫在9 200℃以上，油棕終年都能開花結(jié)果。我國華南地區(qū)除海南島南部≥15℃的有效積溫在9 000℃左右［4］，其他地區(qū)≥10℃的年有效積溫在5 000～8 000℃，比馬來西亞低很多［7］。

研究表明，有效積溫與油棕的營養(yǎng)生長、產(chǎn)量以及抗寒性顯著相關(guān)，對果穗數(shù)量（NB）、鮮果實產(chǎn)量（NFF）、果實數(shù)量（ANF）、正常果實數(shù)量（ANNF）和果穗比（F/B）具有決定影響，有效積溫較高時能提高葉片生長量、果穗數(shù)量、果實數(shù)量及果穗比，從而提高了油棕的鮮果實產(chǎn)量。此外，年≥10℃的有效積溫與低溫半致死溫度（LT50）呈顯著正相關(guān)，較低的有效積溫有利于篩選出抗寒力較強的油棕植株［8-9］。

2 油棕抗寒力的鑒定指標

2.1 生理生化指標

油棕在受到低溫脅迫時，葉片的生理生化指標會發(fā)生一系列的變化，以應(yīng)對不良環(huán)境。研究表明，隨溫度的降低，葉片受害指數(shù)增加［3，10］，相對含水量下降，但變化不明顯［11］；相對電導(dǎo)率上升［10，12-14］或先下降后上升［15］；丙二醛 （MDA）含量上升［10-11，16］或先下降后上升［14-15］或先上升后下 降［12］； 脯 氨 酸 含 量 升 高［10，16］或 先 升 高 后 下降［12，14-15］；可溶性糖含量上升［11，14-16］或下降［17］；可溶性蛋白含量上升［12，16］或先上升后下降［11，15］；SOD 活性上升［14］或先上升后下降［10，16］或下降［11］；CAT［11，16］、POD［10-11，16］、GR［16］活性先上升后下降；葉綠素含量呈波動變化［12，14］；葉片養(yǎng)分含量氮和磷呈下降趨勢，鉀和鎂呈先降低后升高，銅和鐵含量都比自然溫度處理下低，錳和鋅都比自然溫度處理下高［18］；凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均下降，胞間CO2濃度先顯著上升后顯著下降，水分利用率和氣孔限制值先上升后下降，葉片熒光參數(shù)初始熒光上升，PSⅡ最大光化學(xué)效率、光化學(xué)猝滅系數(shù)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)均下降［19］。不同生理指標對低溫的敏感程度不同，對低溫的忍耐性也存在差異，輕度低溫脅迫可以啟動植物自身的防御能力，引起相關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和抗氧化酶活性的增加，當?shù)蜏孛{迫超過某一臨界值時，植物本身的防御機能減弱，脯氨酸和可溶性糖的含量以及抗氧化酶的活性降低，活性氧代謝系統(tǒng)受到破壞，最終導(dǎo)致植物細胞受損或死亡［10，15］。

油棕葉片的生理生化指標在低溫脅迫下產(chǎn)生不同程度的變化，能夠初步反映植株對低溫的耐受程度，是評價油棕抗寒性的重要手段。相對電導(dǎo)率、MDA 含量、可溶性糖和脯氨酸含量與油棕的抗寒性密切相關(guān)［12，15］，可以作為抗寒評價的參考指標。近年來，許多研究表明，利用電導(dǎo)率結(jié)合Logistic 方程求出低溫半致死溫度（LT50）能準確直觀地反映植物抗寒力［13，20］，因此，也被認為是鑒定油棕抗寒性的重要評價指標。由于涉及的生理指標較多，為了更準確科學(xué)地評價油棕的抗寒性，需要建立可靠的抗寒性評價體系，為挖掘、篩選和利用優(yōu)良種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)。

2.2 葉片組織形態(tài)指標

油棕葉片由表皮、葉肉和葉脈3部分組成，上下表皮均有氣孔、角質(zhì)層、表皮層和內(nèi)皮層，與其他禾本科植物一樣，油棕葉片上表皮細胞下方存在泡狀細胞；葉肉由柵欄組織和海綿組織組成，柵欄組織無分化，只有上柵欄組織，上柵欄組織呈山峰狀或柵欄狀排列；中脈多達4～12 個維管束，且形式排列多樣［21］。研究還表明，低溫脅迫時油棕葉片細胞不斷失水，細胞間隙越來越大，柵欄組織細胞變長，海綿組織細胞邊緣越來越不規(guī)則，葉片厚度、海綿組織厚度和柵欄組織厚度均逐漸減小，嚴重時幾乎無法區(qū)分柵欄組織和海綿組織［22］。Alwee 等［23］研究了油棕開花過程中分生組織的解剖結(jié)構(gòu)的變化。Abe 等［24］用近紅外光譜研究了不同油棕資源在維管束和薄壁組織方面的差異。Luis 等［25］比較了油棕溫室培養(yǎng)的種苗和試管苗在葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)兩種環(huán)境條件下生長的油棕幼苗的解剖結(jié)構(gòu)基本相似，但試管苗的表皮細胞較薄，葉片的中脈由3～4 條維管束組成，而大棚培育的種子幼苗葉片較厚，葉片的中脈較粗，中央只有1條維管束。

油棕葉片組織形態(tài)與抗寒性關(guān)系的研究還比較薄弱，目前尚難以通過葉片組織形態(tài)指標準確評價油棕的抗寒性。曾憲海等［26］研究認為，葉片上角質(zhì)層厚度和海綿組織厚度是影響油棕抗寒力（LT50）的重要因素。阮志平［27］比較了布迪椰子、沼地棕和油棕3種棕櫚科植物的葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異，研究認為，油棕抗寒性與細胞組織緊密度和細胞組織疏松度不具有相關(guān)性，而與是否分化出柵欄組織和海綿組織具有顯著相關(guān)性，不耐寒的油棕葉片薄，角質(zhì)層微弱，表皮薄，海綿組織發(fā)達，柵欄組織細胞較長且排列疏松與油棕耐寒性弱有一定的關(guān)系。焦云飛［28］比較了廣東、云南、海南、廣西和福建5個地區(qū)的油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的特征，研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)油棕種質(zhì)材料間的組織解剖結(jié)構(gòu)存在顯著差異，認為上下角質(zhì)層厚的植株具有潛在的抗寒性。曹紅星等［22］研究了不同低溫處理下油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異，研究認為，葉片厚度和組織疏松度（SR）在不同低溫處理下變化明顯，可以作為油棕抗寒種質(zhì)鑒定的結(jié)構(gòu)指標。

3 油棕抗寒分子生物學(xué)研究

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善發(fā)展，對油棕抗寒的研究逐步從生理水平深入到分子水平。近年來，利用生物技術(shù)手段，鑒定并克隆了一些與油棕抗寒相關(guān)的基因。CBF 轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族，與油棕抗寒相關(guān)的3 個CBF1、CBF2和CBF3同源基因己克隆，其DNA 全長分別為700、1 060 和 663 bp［29］。肖勇等［30］采用同源序列法，克隆了3個拷貝的CBF基因，通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，克隆的CBF基因與NCBI數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的CBF基因具有很高的同源性。Lei 等［31］基于耐寒轉(zhuǎn)錄組分析，AP2/ERF 家族成員的CBF 轉(zhuǎn)錄因子在油棕的耐寒性中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，但CBF信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游的COR基因的啟動子發(fā)生變異，從而不能被CBF誘導(dǎo)。將CBF轉(zhuǎn)錄因子進一步在轉(zhuǎn)基因番茄中進行功能驗證，表明CBF/DREB 轉(zhuǎn)錄因子在油棕的低溫脅迫中起著重要的調(diào)節(jié)作用，CBF 轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)節(jié)乙烯信號途徑提高油棕的抗寒能力［32-33］。CBF3轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)油棕成熟果實的非生物脅迫反應(yīng)，也可以充當果實成熟過程相關(guān)基因的調(diào)節(jié)劑［34］。Li等［14］研究了在不同溫度梯度處理下，油棕 各 種 基 因 （COR410，COR413，CBF1，CBF2，CBF3，ICE1-1，ICE1-2，ICE1-4，SIZ1-1，SIZ1-2，ZAT10）的表達水平以及與生理指標之間的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)，CBF與其他基因存在明顯的相關(guān)性，尤其在12℃冷處理下，CBF1和CBF3與上游調(diào)節(jié)因子ICE1和SIZ1之間存在顯著的正相關(guān)，在低溫脅迫下，CBF1和CBF2的表達也與可溶性糖和脯氨酸的積累呈正相關(guān)。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在油棕的生長發(fā)育和非生物脅迫中均起著重要的作用［35］。周麗霞等［36］利用實時熒光定量PCR 技術(shù)從油棕中獲得了WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40、和WRKY555 個低溫應(yīng)激反應(yīng)型基因。Chen 等［37］研究了油棕EgFAD8基因的啟動子在低溫下被誘導(dǎo)表達。Zhang等［38］研究發(fā)現(xiàn)，油棕EgWRI1基因的啟動子在低溫脅迫下活性降低。

分子標記已被廣泛應(yīng)用于分析油棕的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)等性狀相關(guān)標記的鑒定和基因型特征，但與油棕抗寒相關(guān)分子標記研究較少。Xiao 等［39］對油棕低溫脅迫處理下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，找到了大量的SSR標記，并發(fā)現(xiàn)了與油棕耐寒緊密連鎖的SSR 標記，其中2 個SSR 標記分別位于CBF基因和ICE1基因的5’非翻譯區(qū)，這些SSR 標記將為后續(xù)的油棕耐寒性分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

植物生長發(fā)育過程中的基因表達受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后mRNA調(diào)控，已經(jīng)在許多植物中證明，RNA結(jié)合蛋白（RBP）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控增強了植物對非生物脅迫的耐受性，Yeap 等［40］從油棕中鑒定并分離了一個新型的小hnRNP 樣RNA 結(jié)合蛋白EgRBP42，它與應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物相互作用，并在低溫、干旱、鹽等非生物脅迫反應(yīng)中被誘導(dǎo)，隨后通過轉(zhuǎn)基因擬南芥驗證，EgRBP42通過結(jié)合富含AG的基序?qū)?yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄物從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，EgRBP42過表達增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對非生物脅迫的耐受性［41］。

4 油棕抗寒栽培技術(shù)研究

選擇適宜的種植區(qū)域、優(yōu)良的油棕品種及其配套的栽培技術(shù)是我國油棕產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。目前關(guān)于提高油棕抗寒能力的栽培措施較少。陳禮培［42］研究發(fā)現(xiàn)施用100 mg/L 多效唑，含磷、鉀元素高的復(fù)合肥以及3 000 mg/L的奧普爾有機肥都能提高油棕的抗寒能力。土壤速效鉀含量與油棕的耐寒性呈正相關(guān)，較高的土壤速效鉀含量有利于提高油棕的耐寒性［9］。采用草繩包扎樹身，用薄膜紙覆蓋嫩葉等也能起到抵御寒冷的作用［43］。此外，在油棕引種或移植時最好選擇春夏季，由于春夏氣溫較高，與油棕的原產(chǎn)地溫差懸殊不大，油棕更易適應(yīng)新的環(huán)境，不易造成凍傷。

通過噴施植物生長調(diào)節(jié)劑提高植物的抗寒性已有較多報道。劉世紅等［20］發(fā)現(xiàn)內(nèi)源激素IAA 和ABA 含量的增加利于提高油棕的抗寒性，遇低溫時噴施適宜濃度的外源激素ABA 可提高油棕的抗寒力［44］。研究表明低溫脅迫能誘導(dǎo)油棕幼苗ABA 合成酶基因NCED3的過量表達，說明ABA 參與油棕幼苗響應(yīng)低溫脅迫來維持正常的生長發(fā)育，而外施適宜濃度的ABA能提高可溶性糖、可溶性蛋白含量和POD 活性，抑制丙二醛和H2O2含量上升，從而提高了油棕的耐寒性［45］。

5 油棕抗寒育種研究

5.1 品種抗寒性鑒定

李靜等［15］對引種到廣東江門試種的10個油棕新品種熱油31～40 號的抗寒性進行調(diào)查表明，在經(jīng)歷過2012 年冬季低溫寒害后，10 個油棕新品種在江門地區(qū)均能順利過冬，其中熱油31 號、熱油39號、熱油40號的抗寒性較強。曹紅星等［16］對引種哥斯達黎加的油棕品種TE、BE、OG 和海南本地品種BD進行抗寒性鑒定表明，4個油棕品種抗寒性強弱的順序依次為TE＞BE＞BD＞OG。曹紅星等［13］以低溫半致死溫度（LT50）探討了引自馬來西亞的YGH、GH、HRU 3個油棕品種、非洲科特迪瓦的油棕品種OPKT 和海南本地厚殼種OPBD 的抗寒力，結(jié)果表明海南本地厚殼種OPBD 和非洲科特迪瓦OPKT 的2 個品種抗寒力強，可以作為抗寒育種的材料。曹建華等［46］在2008 年南方低溫寒害天氣后對12 個油棕品種RYL1～RYL12 的花果受害情況進行了田間抗寒性觀測，發(fā)現(xiàn)不同品種之間抗寒能力差異較大，但均能恢復(fù)生長并正常開花結(jié)果。

5.2 新品種培育

哥斯達黎加1967 年從喀麥隆巴門達海拔1 000～2 000 m 的高地收集了低產(chǎn)量和低出油率（7.7%）的耐寒種子，其自交第二代的果穗產(chǎn)量和出油率顯著提高；1976 年從坦桑尼亞的基戈馬地區(qū)海拔1 000 m 的高地收集了耐寒薄殼油棕種質(zhì)資源，其自交第二代的厚殼種的果穗產(chǎn)量較高（261.5 kg/株）［47］。哥斯達黎加 ASD 公司利用原產(chǎn)于坦桑尼亞和喀麥隆生長的抗寒性強Dura型油棕，與哥斯達黎加的高產(chǎn)、早熟Tenera品種進行雜交培 育 出Banenda×AVROS、Tanzania×Ekona、Tanzania×AVROS等抗寒高產(chǎn)油棕品種，產(chǎn)油量是不抗寒油棕的4倍，并已經(jīng)成功引種到非洲的許多高緯度、高海拔地區(qū)進行試種［48］。哥斯達黎加ASD公司從油棕育種研究站篩選的油棕種子引入哥斯達黎加進一步改良，Ekona×Deli雜交品種在3～4個月的寒冷天氣下表現(xiàn)良好的耐寒性，可以作為抗寒育種的材料［49］。2005 年，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院從國外引進試種的油棕種群中，分離出抗寒無殼種父本材料8株；2010年從國外引進抗寒親本種子材料2 份，共培育出422 株種苗；2009～2013 年在我國熱區(qū)油棕種植地調(diào)查，篩選出抗寒厚殼種母本材料 112 份，共培育 3 500 株種苗［50］。2019年，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所選育出我國第一個油棕品種“熱油4 號”，該品種具有早花早果、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)、抗旱和抗風性較強、適應(yīng)性廣等特點；同時，初選出我國第一個抗寒、高產(chǎn)、矮生、高不飽和脂肪酸含量的無殼型油棕品種“熱油40號”，該品種在儋州、海口和昌江試種成功，有望在短期內(nèi)實現(xiàn)良種產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。

6 存在的問題及展望

目前，我國油棕抗寒相關(guān)研究還比較薄弱。（1）研究材料較為單一，主要集中于油棕幼苗的葉片，而關(guān)于油棕根莖在低溫脅迫下的生理生化、組織形態(tài)變化的研究較少；在研究手段方面，對油棕抗寒性研究的溫度控制多是在實驗室內(nèi)人工操作完成的，與自然環(huán)境的變化存在一定差異。（2）在油棕抗寒性評價方面，還未曾建立可靠、高效、完整的抗寒評價系統(tǒng)，與油棕抗寒性相關(guān)的生理指標較多且機理復(fù)雜，單一指標很難反映植物的抗寒本質(zhì)，需要明確各個指標之間的關(guān)系及協(xié)同作用，利用多個指標進行綜合分析，為油棕的抗寒性評價提供科學(xué)依據(jù)。（3）綜合抗寒栽培技術(shù)措施缺乏，目前主要集中在外源激素調(diào)控作用的研究，今后深入研究油棕抗寒機理的同時需要配合一些防寒措施（合理施肥、科學(xué)栽培管理、化學(xué)調(diào)控等）作為增強油棕抗寒力的手段。（4）與油棕抗寒相關(guān)的基因只有少部分被分離、鑒定，并且這些基因在抗寒過程中表現(xiàn)的具體作用及表達調(diào)控機制仍需進一步深入研究，今后可以通過收集抗寒性較強的油棕種質(zhì)資源，挖掘新的抗寒基因，充分研究這些基因在低溫脅迫下的冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（5）利用基因工程手段將外源抗寒基因?qū)胫参镏?，在其他作物中取得了很大的進展，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油棕抗寒性的研究主要用于抗寒基因的功能驗證，缺乏其他抗寒基因的發(fā)現(xiàn)和導(dǎo)入，今后應(yīng)加強對其他林木抗寒基因的篩選獲得安全有價值可用于轉(zhuǎn)化的外源抗寒基因，廣泛應(yīng)用基因工程手段獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植株。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善發(fā)展，探究與油棕抗寒相關(guān)的基因、低溫誘導(dǎo)蛋白和分子標記，深入研究油棕低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)機制是未來油棕抗寒性研究的重要任務(wù)，以期從分子水平對油棕抗寒機理做更科學(xué)系統(tǒng)的解釋。