易英 郝香月 涂鈺瑩 龍孝斌

感音神經(jīng)性聽力下降可以由聽覺傳導(dǎo)通路中的耳蝸、聽神經(jīng)、腦干聽覺通路和聽覺中樞病變引起，其中耳蝸毛細(xì)胞極其脆弱，易受藥源性、病原性以及噪聲暴露等諸多因素?fù)p傷?，F(xiàn)已有斑馬魚、鳥類和哺乳動物等多種脊椎動物模型被用于聽覺系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的研究[1]，斑馬魚因體型小、繁殖周期短、幼魚透明、產(chǎn)卵量大、與人類基因同源性高，被廣泛用于構(gòu)建人類疾病模型和大規(guī)模的化學(xué)藥物和遺傳篩選[2, 3]。大量關(guān)于斑馬魚毛細(xì)胞再生的研究為哺乳動物毛細(xì)胞再生提供了潛在的靶點；因哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞不能自發(fā)再生，目前研究主要圍繞著體外誘導(dǎo)前體細(xì)胞和干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞。了解調(diào)控毛細(xì)胞發(fā)育的信號通路是毛細(xì)胞再生研究的另一方向；在斑馬魚、小鼠或禽類動物毛細(xì)胞發(fā)育及再生過程中，Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、Sonic hedgehog(Shh)信號通路、FGF信號通路等都起著關(guān)鍵作用，不同通路之間相互聯(lián)系、相互作用，共同組成調(diào)節(jié)毛細(xì)胞發(fā)育再生的信號網(wǎng)絡(luò)。本文從Wnt/β-catenin信號通路、Shh信號通路、Notch信號通路入手，綜述其在聽覺毛細(xì)胞再生過程中的研究進(jìn)展，以初步了解多信號通路在毛細(xì)胞發(fā)育中的相互聯(lián)系。

1 毛細(xì)胞再生的發(fā)現(xiàn)

1987年，Cotanche在研究氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)雛雞毛細(xì)胞死亡的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)雛雞基底乳頭中感覺上皮再生的現(xiàn)象，打破了之前人們對脊椎動物毛細(xì)胞在有絲分裂后聽覺感覺上皮細(xì)胞受損后基本不能再生的認(rèn)知[4]。1988年，Cotanche利用噪聲誘導(dǎo)雛雞毛細(xì)胞死亡后亦發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞再生的情況[5]，而后2003年Harris首次以新霉素處理致斑馬魚毛細(xì)胞損傷后，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)再生情況呈劑量反應(yīng)相關(guān)性[6]。盡管鼠類基因與人類基因有99%的相似性，更適合用于研究哺乳動物毛細(xì)胞再生機制，但其繁殖周期長、成本高等缺點限制了小鼠模型的發(fā)展。近年來學(xué)者們對于體外誘導(dǎo)哺乳動物聽覺毛細(xì)胞再生的研究逐步深入，最初，Kawamoto等[7]利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染Math1基因至豚鼠的耳蝸，在Cozti器、內(nèi)溝細(xì)胞、Hensen細(xì)胞區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了不成熟的毛細(xì)胞；隨后，編碼Atoh1的腺病毒轉(zhuǎn)染耳蝸感覺上皮并原位誘導(dǎo)毛細(xì)胞形成，Notch抑制劑DAPT和Atoh1的聯(lián)合應(yīng)用增加了Atoh1表達(dá)水平并降低了hes1和hes5水平，進(jìn)一步促進(jìn)了體外毛細(xì)胞的產(chǎn)生[8]。小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)新生小鼠毛細(xì)胞在注射白喉毒素誘導(dǎo)損傷后，支持細(xì)胞保持著有限的瞬時再生能力[9, 10]。

2 毛細(xì)胞再生的來源

在成年哺乳動物及人類內(nèi)耳中，極少數(shù)前庭毛細(xì)胞可自發(fā)再生，而目前研究顯示耳蝸毛細(xì)胞損傷后是無法自發(fā)再生的[11]。與成熟哺乳動物耳蝸不同，新生的小鼠耳蝸毛細(xì)胞在損傷后具有短暫的自發(fā)再生能力[10]；而鳥類、斑馬魚和兩棲動物的相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)再生毛細(xì)胞來源。

2.1非哺乳動物毛細(xì)胞再生來源 雛雞支持細(xì)胞通過兩種不同的機制產(chǎn)生新的毛細(xì)胞：①支持細(xì)胞有絲分裂分化再生;②支持細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)分化，即一種細(xì)胞改變其表型而獲得另一種分化狀態(tài)，但這一過程不進(jìn)入細(xì)胞周期[12]。斑馬魚作為另一種非哺乳動物模型，其側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞與內(nèi)耳毛細(xì)胞同源，影響側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞功能的突變也會導(dǎo)致人類耳聾。側(cè)線神經(jīng)丘是由處在中央?yún)^(qū)的感覺毛細(xì)胞、位于毛細(xì)胞下方的支持細(xì)胞和環(huán)形包繞神經(jīng)丘的蓋細(xì)胞共同組成的。Romero-Carvajal通過70小時延時記錄跟蹤側(cè)線毛細(xì)胞譜系，發(fā)現(xiàn)在新霉素處理后，支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是側(cè)線毛細(xì)胞再生的主要途徑，其次少數(shù)支持細(xì)胞通過有絲分裂增殖分化為毛細(xì)胞，極少數(shù)情況下藥物嚴(yán)重?fù)p傷神經(jīng)丘導(dǎo)致支持細(xì)胞耗竭，蓋細(xì)胞才能進(jìn)入細(xì)胞周期轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞[13]。

2.2哺乳動物毛細(xì)胞再生的可能來源 毛細(xì)胞極易受到感染、噪聲和藥物(如：鉑類[14,15]、氨基糖苷類藥物、銅)等因素的損害[4]。目前體外研究中哺乳動物毛細(xì)胞再生的可能來源如下：①前體細(xì)胞(存在于耳蝸內(nèi)，在分化階段上處于毛細(xì)胞上游，并能夠進(jìn)一步分化成毛細(xì)胞的細(xì)胞):Wnt信號通路的靶基因Lgr5標(biāo)記的耳蝸支持細(xì)胞在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)為感覺前體細(xì)胞，而這些細(xì)胞具有再生毛細(xì)胞的內(nèi)在能力[16]。②支持細(xì)胞：新生小鼠支持細(xì)胞保持著有限的瞬時再生能力，且能夠下調(diào)細(xì)胞周期抑制劑，重新進(jìn)入細(xì)胞周期并在體外培養(yǎng)中產(chǎn)生毛細(xì)胞[9]。White等[17]從新生小鼠耳蝸中分離的支持細(xì)胞可在體外增殖，并具有轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的潛能，但這種增殖能力在小鼠出生后的第2周停止。③小上皮嵴細(xì)胞：Zhai等[18]從大鼠小上皮嵴分離得到前體細(xì)胞,當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)Hathl基因時，這些前體細(xì)胞表現(xiàn)出毛細(xì)胞樣細(xì)胞的特征，將這些細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)能產(chǎn)生具有毛細(xì)胞特異標(biāo)記的細(xì)胞。④干細(xì)胞：干細(xì)胞因強大的自我更新能力和多向分化潛能等優(yōu)點，為哺乳動物毛細(xì)胞再生提供了一個更具前景的方向。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)、內(nèi)耳干細(xì)胞(inner stem cell,IESC)以及外源性成體干細(xì)胞(嗅覺上皮細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等)都具有分化為毛細(xì)胞的潛能[19]。雖然眾多研究顯示干細(xì)胞能在體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞，但移植的方式、移植細(xì)胞的分化階段、新生毛細(xì)胞的功能和特性以及移植后的穩(wěn)定性、安全性等都還需要進(jìn)一步的研究，而其中最為關(guān)鍵是需要恰當(dāng)?shù)卣{(diào)控再生毛細(xì)胞的數(shù)量及其定位，以期發(fā)揮毛細(xì)胞正常功能。

3 毛細(xì)胞再生關(guān)鍵調(diào)控因子及相關(guān)途徑

目前研究顯示毛細(xì)胞再生是多靶點多基因調(diào)控的過程，其中以Wnt/β-catenin信號通路和Notch信號通路的研究最為深入；此外還有Shh信號通路、FGF信號通路、JAK-STAT等，各個通路之間有聯(lián)系亦有區(qū)別[20, 21]。相關(guān)的調(diào)控因子也有很多，如：Shh、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、轉(zhuǎn)錄激活因子3(stat3)、維甲酸(retinoic acid,RA)、組蛋白H3K9二甲基化( dimethylation of lysine 9 on histone H3,H3K9me2)、microRNA 183家族[22～26]等。

3.1Wnt/β-catenin信號通路 Wnt信號通路在細(xì)胞發(fā)育、生長和再生過程中起重要作用，目前可以分為以下三類，經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路、Wnt/PCP信號通路以及Wnt/calcium信號通路，其中經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路研究較為成熟。Wnt是一組富含半胱氨酸的分泌性蛋白,廣泛存在于各種動物及各種組織中。由于Wnt信號與受體Frzzled結(jié)合，引發(fā)低密度脂蛋白相關(guān)受體蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)被糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK3)和其他激酶磷酸化，從而使Axin與LRP結(jié)合，致使Axin/APC/GSK3/β-catenin復(fù)合物解離，避免β-catenin被GSK3磷酸化從而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與TCF結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄[27]。

研究報道Wnt/β-catenin不僅在斑馬魚后側(cè)線細(xì)胞遷移起重要作用[28]，并且參與哺乳動物內(nèi)耳早期的聽基板及聽泡的分化[29]。Head等[30]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚神經(jīng)丘在穩(wěn)態(tài)或氨基糖苷類損傷后，GSK3β抑制劑(1-azakenpaullone)刺激Wnt信號通路引起支持細(xì)胞增殖顯著增加；另一方面過表達(dá)dkk1b抑制Wnt信號傳導(dǎo)可抑制毛細(xì)胞發(fā)育和再生過程。此外，Wnt信號可與dkk2形成負(fù)調(diào)控循環(huán)，維持神經(jīng)丘形態(tài)及大小[31]；而在電離輻射處理后的斑馬魚可通過釋放dkk2抑制Wnt信號通路，同時抑制支持細(xì)胞的活性導(dǎo)致毛細(xì)胞再生障礙[32]；這些研究表明，Wnt信號通路對調(diào)控毛細(xì)胞發(fā)育、生長和再生過程中支持細(xì)胞增殖起重要作用。Jiang等[33]在新霉素導(dǎo)致斑馬魚毛細(xì)胞死亡后1、3和5 h對神經(jīng)丘進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Notch和Fgf信號在再生的最初幾個小時內(nèi)被下調(diào)，而Wnt信號在再生的前10個小時內(nèi)沒有被激活，說明Wnt沒有參與觸發(fā)毛細(xì)胞增殖的初始階段。總而言之，雖然Wnt通路明顯影響再生毛細(xì)胞的數(shù)量，但卻不觸發(fā)再生。

盡管許多研究已經(jīng)明確了經(jīng)典Wnt信號通路在哺乳動物耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育過程中的作用，但其在哺乳動物毛細(xì)胞再生中的具體作用有待進(jìn)一步研究。Li等[34]發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號通路可誘導(dǎo)新生小鼠耳蝸支持細(xì)胞中β-catenin的過表達(dá)和Wnt下游靶基因的激活，表現(xiàn)為Lgr5+支持細(xì)胞增殖并促使它們向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。富含亮氨酸G蛋白偶聯(lián)受體5(leucinerich repeat-contianing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)是近年來發(fā)現(xiàn)的Wnt信號通路的靶基因，是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的成員之一。Lgr5+支持細(xì)胞在體內(nèi)和體外通常都處于靜止?fàn)顟B(tài)，但當(dāng)它們分離為單個細(xì)胞時將具有增殖和轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞的能力。Shh信號傳導(dǎo)的激活亦促進(jìn)Lgr5+祖細(xì)胞的增殖和隨后的毛細(xì)胞分化[21]。此外，Lgr5+支持細(xì)胞過表達(dá)β-catenin和Atoh1，可增加Lgr5+支持細(xì)胞增殖分化為毛細(xì)胞，但新生的毛細(xì)胞仍為不完全成熟的毛細(xì)胞[35]，卻為研究哺乳動物毛細(xì)胞再生提供了可行的新方向。最近一項研究[36]發(fā)現(xiàn)Wnt和Notch信號通路在Lgr5+祖細(xì)胞和Lgr6+祖細(xì)胞中基因表達(dá)水平相似，與Lgr5+祖細(xì)胞相比，Lgr6+祖細(xì)胞具有更強大的分化為毛細(xì)胞的能力，而Lgr5+祖細(xì)胞比Lgr6+祖細(xì)胞具有更強的增殖能力。

3.2Shh信號通路 Shh是Hedgehog(Hh)基因家族中的一類，也是目前研究廣泛的信號通路之一。Shh信號通路在胚胎發(fā)育過程中參與調(diào)控多個器官及組織的生長發(fā)育。分泌性配體Shh結(jié)合其受體Ptch，減弱了Ptch對Smo的抑制作用，Smo膜蛋白去阻遏，激活Gli轉(zhuǎn)錄因子,觸發(fā)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄[37]。

研究發(fā)現(xiàn)Shh信號與內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)育關(guān)系十分密切[21],特別在背腹軸(dorsoventral axis，D-V 軸)的形成中起到關(guān)鍵性作用。Shh信號通路轉(zhuǎn)錄因子Gli3R和Gli2/3A之間的平衡調(diào)控著哺乳動物內(nèi)耳D-V 軸的長度[38]。Shh濃度影響著內(nèi)耳原基的發(fā)育分化方向，內(nèi)耳原基中Shh濃度高的部位發(fā)育成腹側(cè)的聽覺器官，Shh濃度低的部分發(fā)育成前庭器官。亦有研究發(fā)現(xiàn),Shh通過調(diào)節(jié)cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)的濃度，從而抑制Gli3活性，影響小鼠內(nèi)耳發(fā)育中的腹側(cè)極性[39]；在沒有新霉素處理的情況下，Shh信號通路上調(diào)并沒有顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖或新的毛細(xì)胞形成，然而，在新霉素?fù)p傷感覺上皮后，過度激活Shh信號導(dǎo)致新生小鼠耳蝸上皮外植體中支持細(xì)胞增殖和毛細(xì)胞再生,并提出Fgf、Wnt、Notch和Hedgehog信號通路之間復(fù)雜的相互作用促進(jìn)毛細(xì)胞再生，Mfng基因可能是Hedgehog信號通路的下游靶標(biāo)，并可能作為耳蝸感覺上皮細(xì)胞中Hedgehog和Notch信號通路之間的介質(zhì)[21]。雖然現(xiàn)已有很多研究分析了Shh作用于耳蝸發(fā)育期間的信號傳導(dǎo)，但其在毛細(xì)胞再生過程中的作用有待進(jìn)一步研究。

3.3Notch信號通路 Notch信號通路是一種進(jìn)化上保守的通路，可以抑制各種組織中的細(xì)胞模式：如增殖、分化和凋亡。哺乳動物具有4種不同類型的Notch受體(Notch 1～4)和5種Notch配體(Jagged 1、Jagged 2和Deltal、Delta3、Delta4 )，Notch受體由胞外區(qū)(N-terminal extracellular do main，NEC)、跨膜區(qū)(transmembrane domain，TM) 和胞內(nèi)區(qū)((Notch intracellular domain，NICD)3部分組成。當(dāng)相鄰細(xì)胞表面的Delta或Jagged配體與Notch受體結(jié)合后，Notch受體蛋白水解，釋放NICD，然后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中與DNA結(jié)合蛋白CSL結(jié)合并形成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，隨后MAML轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族與該復(fù)合物結(jié)合，從而誘導(dǎo)了Notch靶向基因的轉(zhuǎn)錄[40]。

在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中，Notch信號通路使胚胎前體感覺細(xì)胞定向分化成毛細(xì)胞，同時形成支持細(xì)胞，亦通過側(cè)抑制發(fā)揮作用，使新生的毛細(xì)胞中抑制Atohl和其他促進(jìn)毛細(xì)胞分化的基因表達(dá)。Atoh1在耳蝸上皮細(xì)胞中過度表達(dá)可誘導(dǎo)新的毛細(xì)胞形成，腺病毒介導(dǎo)的Atoh1過度表達(dá)主要使用在大鼠小上皮嵴并誘導(dǎo)異位毛細(xì)胞再生，但轉(zhuǎn)導(dǎo)率低[8]。但Notch抑制劑DAPT和Atoh1的聯(lián)合應(yīng)用增加了Atoh1表達(dá)水平并降低了hes1和hes5水平，促進(jìn)體外大鼠耳蝸感覺上皮細(xì)胞毛細(xì)胞再生[8]。Walters等[20]提出GATA3或POU4F3和ATOH1的共活化促進(jìn)成年小鼠中SCs向HC的轉(zhuǎn)化，遺憾的是，雖然GATA3或POU4F3的異位表達(dá)能夠克服Atoh1介導(dǎo)的SC轉(zhuǎn)化的年齡限制，但轉(zhuǎn)化的細(xì)胞仍然不成熟。

4 聽覺毛細(xì)胞發(fā)育和再生過程中信號通路之間的相互作用

Notch和Wnt信號傳導(dǎo)是耳蝸發(fā)育期間的前體細(xì)胞增殖和細(xì)胞再生過程中必不可少的信號通路。調(diào)節(jié)任一途徑中的信號傳導(dǎo)是毛細(xì)胞再生的潛在的研究方向。隨著研究深入，最近發(fā)現(xiàn)Notch和Wnt信號在毛細(xì)胞發(fā)育和再生中有相互調(diào)控作用[13, 34]。抑制小鼠毛細(xì)胞有絲分裂時Notch傳導(dǎo)，Wnt信號在Lgr5+支持細(xì)胞中被激活并促進(jìn)它們進(jìn)入細(xì)胞周期并分化成毛細(xì)胞，表明Notch信號傳導(dǎo)對毛細(xì)胞祖細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)活性發(fā)揮起抑制作用；因此，通過干擾Notch和Wnt信號傳導(dǎo)之間的相互作用來靶向兩種途徑提供了毛細(xì)胞有絲分裂發(fā)生的潛在方法。支持細(xì)胞中的Notch抑制和Wnt活化同時顯著促進(jìn)前庭毛細(xì)胞的有絲分裂生成，這比單獨調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)更有效[41]。

在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中，Shh通路與Wnt通路相互拮抗，同時Notch、FGF、BMP等多條信號通路形成了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，共同調(diào)控和維持內(nèi)耳發(fā)育。尤其在小鼠內(nèi)耳D-V 軸的形成中Shh通路與Wnt通路起著決定性的作用，Wnt的靶基因主要位于背側(cè)，Shh的靶基因主要位于腹側(cè)，這也是耳蝸與前庭系統(tǒng)、聽覺系統(tǒng)形成差異的關(guān)鍵因素，Shh通路與Wnt通路相互拮抗維持內(nèi)耳形態(tài)發(fā)育的平衡，Shh信號通路通過抑制Dlx5/6，從而降低耳蝸背側(cè)Wnt信號通路的活性；此外在缺乏后腦的內(nèi)耳外植體中，腹側(cè)Shh靶基因Pax2和Ngn1的表達(dá)沿著耳蝸的側(cè)壁異位擴展，說明Wnt信號對腹側(cè)Shh信號的表達(dá)有抑制作用[42]。

Shh信號通路、FGF信號通路和Notch信號傳導(dǎo)靶基因相互作用以調(diào)控聽覺毛細(xì)胞分化模式。在耳蝸前體細(xì)胞中，Shh信號通路通過維持Notch效應(yīng)分子Hey1和Hey2的表達(dá)水平，負(fù)調(diào)節(jié)Atoh1表達(dá)以防止毛細(xì)胞過早分化，此外，Shh信號傳導(dǎo)對Hey1和Hey2的正調(diào)節(jié)很可能是由FGF信號介導(dǎo)；因此，Shh信號-FGF信號-Notch效應(yīng)物Hey1和Hey2-Atoh1可能是誘導(dǎo)毛細(xì)胞的潛在靶標(biāo)[43]。通過中斷這些信號傳導(dǎo)途徑之間的相互作用，抑制Shh信號傳導(dǎo)和/或其下游途徑與Atoh1過表達(dá)結(jié)合以刺激聽覺毛細(xì)胞再生可能是可行的；然而，目前尚未研究該策略的有效性，并且需要進(jìn)一步研究這些信號傳導(dǎo)途徑在損傷后毛細(xì)胞再生中的相互作用。

5 展望

Wnt、Notch、Shh信號通路在調(diào)控內(nèi)耳發(fā)育、支持細(xì)胞和毛細(xì)胞增殖再生過程中起到不可或缺的作用，在可再生生物模型或哺乳動物模型中，通過控制耳蝸發(fā)育期間的前體細(xì)胞增殖和細(xì)胞再生過程中的信號通路，將是毛細(xì)胞再生的潛在研究方向。因此，深入了解毛細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞環(huán)境以及這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之間的相互關(guān)聯(lián)對于研發(fā)治療感音神經(jīng)性聽力損失的新策略將具有重要意義。