高娟， 左文， 王璇，2

1. 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）兒牙預防科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830000）；2. 新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830000）

牙外傷是兒童繼齲病后就診口腔科的第二大主訴疾病，也是臨床工作的重點和難點之一，其中全脫位牙（completely avulsion teeth，CAT）被認為是最嚴重的一種。CAT 是指牙齒受到外力撞擊時完全脫出牙槽窩，牙周膜韌帶撕裂、牙髓組織喪失血供以及牙骨質(zhì)、牙槽骨造成損傷［1］。CAT 多見于7～14 歲的兒童，上頜中切牙最為好發(fā)［2］。目前，對于CAT 臨床首選的治療方法是牙再植術(shù)（tooth replantation，TR），該術(shù)可恢復牙周膜的血供和營養(yǎng)支持，促進牙周膜再生，從而實現(xiàn)全脫位牙再植成功。然而，TR 受多種因素影響，如患牙是否即刻再植、患牙脫離牙槽窩的時間、患牙保存媒介、牙根發(fā)育程度等，把握不當均會導致會導致牙根表面牙周膜壞死，TR 成功率大大降低［3-4］。CAT 再植失敗會導致患牙缺失，不僅影響患兒口腔頜面部的生長發(fā)育與咀嚼功能，而且影響其發(fā)音與美觀，對患兒的心理健康發(fā)展造成極大的影響。

近年來，關(guān)于慢性牙周炎再生牙周組織的研究越來越多，相對于慢性牙周炎的骨質(zhì)缺損和菌群復雜性而言，TR 是CAT 處于急性創(chuàng)傷期的對癥處理，以期實現(xiàn)理想的牙周膜愈合。因此，再生或重建牙周膜是實現(xiàn)CAT 牙周膜愈合的必要條件。能否利用現(xiàn)有的牙周組織再生技術(shù)，提高TR 的成功率，減少CAT 對患兒產(chǎn)生的不利影響，是目前國內(nèi)外學者共同探討的難題。本文就全脫位再植牙牙周組織再生的研究進展作一綜述。

1 種子細胞

1.1 牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）

牙周膜（periodontal ligament，PDL）是圍繞牙根并連接牙根與牙槽骨的致密結(jié)締組織。牙周膜細胞（periodontal ligament cells，PDLs）包括成纖維細胞、成骨細胞、破骨細胞以及未分化的間充質(zhì)細胞。其中最常見的是成纖維細胞，其主要功能是合成膠原、吞噬經(jīng)酶的水解而降解的舊膠原纖維，并具有牙周組織再生修復作用。Seo 等［5］2004 年首次提出PDLSCs 的概念，并發(fā)現(xiàn)PDLSCs 具有再生潛能。該研究通過克隆篩選和磁珠分離的方法獲得成體干細胞克隆株，發(fā)現(xiàn)PDLSCs表達間充質(zhì)干細胞標記物Stro-1 和CD146/MUC18。該實驗將PDLSCs 移植到免疫缺陷的大鼠體內(nèi)，實驗表明PDLSCs 可向成牙骨質(zhì)細胞、脂肪細胞、膠原形成細胞等方向分化，且具有發(fā)育成牙骨質(zhì)-牙周膜樣結(jié)構(gòu)的潛能，在牙周組織修復方面有重要的應用價值。Iwasaki等［6］在體外擴增過程中發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)增加，PDLSCs 的形態(tài)由紡錘體向扁平變寬，且PDLSCs 表現(xiàn)出多種肌成纖維細胞的特征，包括廣泛的應力纖維形成、收縮活性和肌成纖維細胞標記物的表達，表明PDLSCs 在體外擴增過程中自發(fā)分化向成纖維細胞，為臨床提供PDLSCs 培養(yǎng)條件的重要信息。另外，有研究者在PDLSCs 包裹牙齒再植構(gòu)建的模型中，將新的牙周膜纖維垂直插入新形成的骨組織，牙本質(zhì)表面觀察到新的鞘層形成，與對照組相比牙周組織愈合率較高。有研究探討了自體PDLSCs 在治療小型豬牙周炎中的作用，該實驗研究將自體PDLSCs 與HA/TCP 組合移植到實驗性誘發(fā)的小型豬牙周炎骨缺損中，結(jié)果顯示PDLSCs 介導組中牙槽骨的高度恢復到大約正常水平，而對照組的骨再生非常有限或沒有，表明PDLSCs 能夠再生牙周組織。

1.2 牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）

DPSCs 是從牙髓組織分離出的一類間充質(zhì)干細胞，具有自我更新、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能［7］，可以生成血管、神經(jīng)以及牙齒軟硬組織（包括牙本質(zhì)、牙髓復合體、牙槽骨等）［8］。Jin 等［9］在DPSCs 和脂肪間充質(zhì)干細胞骨再生能力對比實驗中表明：DPSCs 具有較強的集落形成能力、增殖能力、遷移能力和血管生成潛能。有研究者分離提取DPSCs 后，發(fā)現(xiàn)DPSCs 形態(tài)特征類似于骨髓間充質(zhì)干細胞且陽性表達增值相關(guān)細胞因子如CD105、CD90、CD70，將DPSCs 回輸?shù)接忻庖呷毕莸男∈蠡蛲皿w內(nèi)時，實驗組可形成牙本質(zhì)-牙髓樣復合體，以上實驗結(jié)果均驗證了DPSCs 具有再生能力。

2 相關(guān)調(diào)節(jié)因子

2.1 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）

FGF-2 是促進傷口愈合和再生的關(guān)鍵細胞因子，研究表明FGF-2 二聚體具有體外活性，可增加創(chuàng)面的肉芽組織和血管密度，改善傷口愈合過程中肉芽組織的形成，促進傷口愈合［9］。Sang-Joun等［10］在建立的犬牙齒全脫位動物模型中，使用FGF-2 溶液（30 μg/0.1 mL）處理后再植，術(shù)后4 周和8 周處死動物進行組織學和組織形態(tài)學觀察，結(jié)果顯示：在損傷的牙根表面使用FGF-2 可以促進犬牙齒置換后的牙骨質(zhì)形成，表明FGF-2 有效地促進了損傷的牙周膜和牙骨質(zhì)的再生。目前研究表明，3～5 ng/mL 的FGF-2 可以促進牙周膜成纖維細胞生長。FGF-2 與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）對骨/骨形成分化的影響相反，并完全抑制BMP-2 和BMP-4 誘導的礦化，提示FGF-2 作為BMPs 的拮抗劑起主導作用，維持了PDLSCs早期韌帶分化的潛能。

堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促進干細胞增殖和遷移的潛能，對多種細胞的增殖、遷移和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。FGF 可以劑量依賴性地調(diào)節(jié)PDLSCs 的增殖，高濃度的bFGF 可以顯著抑制細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。Kang 等［11］證明了bFGF 和BMP-2 的順序應用可以增加ALP 活性，促進礦物質(zhì)沉積，上調(diào)與成骨相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達，增強PDLSCs 的成骨能力。Xu 等［12］在基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）和bFGF 組合促進骨髓干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）介導的牙周膜再生的實驗中，設(shè)置了CAT 直接植入牙槽窩組，BMSCs 與支架材料材料結(jié)合植入牙槽窩組，以及將帶有犬BMSCs 的牙齒放入含有SDF-1 和bFGF（以空白培養(yǎng)基為對照）的溶液中放置3～4 d，然后合并牙齒用支架材料將其植入牙槽窩組，micro CT 三維圖像顯示SDF-1/bFGF組的牙周膜間隙更明顯，牙周膜愈合率最高，根吸收率最低，表明SDF-1 和bFGF 結(jié)合促進CAT 再植牙牙周膜再生。

2.2 溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）

LPA 是人體內(nèi)存在的血清生長因子，是一種衍生自磷脂的信號分子，可促進細胞增殖、分化、遷移，具有促/抗炎、促/抗凋亡的作用，對牙周韌帶有一定調(diào)節(jié)作用［13］。Kim 等［14］研究表明10 μmol/L LPA 可以促進PDLSCs 增殖，增強PDLSCs的存活率。有研究表明LPA 通過控制細胞粘附、遷移和分化來增強細胞修復能力。該研究還表明LPA 通過加速損傷組織的修復，將DPSCs 從缺血誘導的凋亡中置換出來，證明LPA 可以促進DPSCs 增殖。另外，亦有報道表明LPA 通過調(diào)控牙齦成纖維細胞相關(guān)基因調(diào)節(jié)牙周組織炎癥，促進傷口愈合［15］。

2.3 釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix protein，EMPs）

EMPs 是由上皮根鞘分泌的一種可以調(diào)控牙齒礦化的細胞外基質(zhì)蛋白，研究表明，EMPs 可以促進牙周組織再生、降低牙根吸收率［16］。有研究者用含有不同質(zhì)量濃度EMPs 的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)hPDLSCs，結(jié)果顯示低于100 mg/L EMPs 可以促進hPDLSCs 的增殖和細胞活性，當EMPs 濃度高于100 mg/L 時則表現(xiàn)為抑制作用。而在PDLSCs 體外創(chuàng)傷愈合模型中，100 mg/L EMPs 實驗組創(chuàng)緣完全關(guān)閉，優(yōu)于其他質(zhì)量濃度實驗組和對照組，表明EMPs 可以促進牙周組織再生。研究表明，Ⅰ型膠原蛋白（collagen I，Col-I）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）與牙周膜的再生和重塑有關(guān)，Zou 等［17］將100 μg/mL 的EMPs 和50 kPa的機械刺激相結(jié)合可顯著刺激牙周膜成纖維細胞的增殖并提高Col-I 和MMP-1 的表達水平，表明EMPs 在牙周組織再生中具有重要作用。

2.4 白介素-6（interleukin-6，IL-6）

IL-6 是宿主受到若干刺激時產(chǎn)生的多效細胞因子，傳遞防御信號，刺激急性期反應、免疫反應，調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、分化，參與神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，在宿主免疫防御中起著非常重 要 的 作 用［18］。Liu 等［19］將B 細 胞 與hPDLSCs 或hBMSCs 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上清液中IL-6 的濃度均高于這3 種細胞各自單獨培養(yǎng)的濃度。當培養(yǎng)液中IL-6 濃度為0、50、100 和200 ng/ml 時，用抗IL-6 抗體中和IL-6 后對B 細胞增殖無顯著影響，而添加抗IL-6 單克隆抗體后，凋亡B 細胞的百分比以濃度依賴性的方式顯著增加，表明hPDLSCs 可能通過IL-6 抑制B 細胞凋亡。PD-1 是在活化的T 細胞中發(fā)現(xiàn)的抑制共刺激分子，參與機體免疫應答和外周耐受的調(diào)節(jié)。該實驗使用針對PD-1，PD-L1 和PD-L2 的單克隆抗體進行了封閉實驗，證明了PDLSCs 通過體外的PD-1 和PD-L1 相互作用抑制了B 細胞的增殖。B 細胞的活化受T 細胞的影響，而T 細胞受hPDLSCs 抑制，異體PDLSC 移植的動物缺乏體液免疫排斥反應。因此，抑制B 細胞功能與抑制T 細胞活化相結(jié)合，進一步支持了異體PDLSCs 的使用可能是牙齒再生和牙周膜重建的一種新方法。

2.5 調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory cells，Tregs）

甘露糖是一種C-2 葡萄糖的表聚物，目前已發(fā)現(xiàn)D-甘露糖的T 細胞調(diào)節(jié)功能，D-甘露糖通過促進轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號傳導來刺激Tregs 分化［20-21］。Guo 等［21］將經(jīng)葡萄糖或甘露糖預處理的PDLSCs 與T 細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)甘露糖預處理的PDLSCs（M-PDLSCs）比葡萄糖預處理的PDLSCs（G-hPDLSCs）對T 細胞增殖的抑制能力更強。與此同時，該研究在T 細胞+M-hpdlscs 共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)了更多的Foxp3+T 細胞，F(xiàn)oxp3 是Tregs 最重要的分子標記物，F(xiàn)oxp3+T細胞與Treg 正相關(guān)，表明M-hPDLSCs 誘導更多的T細胞分化為Tregs。該研究組篩選了不同的細胞因子發(fā)現(xiàn)：T 細胞+ M-hPDLSC 共培養(yǎng)體系中IL-6 明顯較低，故將T 細胞+ G-hPDLSCs/T + MhPDLSC 混合細胞回植裸鼠體內(nèi)，結(jié)果表明D-甘露糖通過抑制hPDLSCs 中的IL-6 誘導產(chǎn)生更多的Tregs。IL-6在調(diào)節(jié)Treg/Th17 平衡中起著非常重要的作用。Tregs 介導免疫耐受，Th17 介導炎癥反應，二者相互拮抗，保持機體免疫動態(tài)平衡。此外，Treg 被激活之后，可以抑制B 細胞，殺傷細胞以及其他免疫細胞。當機體處于感染狀態(tài)時，Treg 通過調(diào)節(jié)殺傷病原體的T 細胞和引起過度炎癥反應的T 細胞之間的平衡發(fā)揮作用，該研究發(fā)現(xiàn)了d-甘露糖和IL-6 在hPDLSC 免疫調(diào)節(jié)中的新功能，為PDLSCs 再生牙周組織提供新的可能。

3 支架材料的應用

支架材料通常作為細胞的載體，為細胞的生長、增殖、分化提供一個良好的微環(huán)境。理想的支架材料應滿足：生物相容性，生物降解性和類似于細胞自然環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)。目前支架材料廣泛應用于牙周組織再生，為細胞黏附和增殖提供了三維生長空間［22］。

3.1 自體生物材料

有研究者分離犬PDLSCs，并將牙根作為攜帶PDLSCs 的支架，根據(jù)是否涂布纖維連接蛋白和（或）磷酸鈣表面涂層分組，研究表明：纖維連接蛋白和（或）磷酸鈣增加了PDLSCs 在牙根表面的黏附，可以促進PDLSCs 黏附在牙根表面產(chǎn)生新的牙周附著體。

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是一種富含細胞因子和生長因子的自體生物材料。Yang 等［23］在 犬CAT 再 植 時 采 用 富 血 小 板 血 漿（platelet-rich plasma，PRP）浸泡，表明PRP 的應用可以減輕牙固連，增加牙周膜樣和牙骨質(zhì)樣組織的形成。Du 等［24］在大鼠牙周組織骨缺損模型中，設(shè)置黏骨膜瓣覆蓋缺損的對照組，PRF 組和PRF/阿司匹林復合物實驗組進行研究，結(jié)果表明：PRF/阿司匹林復合物可為增強間充質(zhì)干細胞的黏附和生存能力提供適宜的理化微環(huán)境，并在移植早期通過抗炎藥物保護間充質(zhì)干細胞不受宿主免疫系統(tǒng)的影響。PRF 和PRF/阿司匹林復合物均能促進大鼠牙周組織再生，但PRF/阿司匹林復合物的作用比PRF 更明顯，為促進牙周組織再生提供了新的理論依據(jù)，為CAT 再植提供了新的思路。

3.2 人工合成材料

3.2.1 納米支架材料 HydroMatrix（HydM）是近年來開發(fā)用于細胞培養(yǎng)的新型可注射肽納米纖維水凝膠。Nagy 等［25］將PDLSCs 接種在未涂布或涂有HydM 的表面上，生長阻抗測定和細胞活力測定都表明PDLSCs 能夠在HydM 上粘附和增殖；ALP 活性和von Kossa 染色證明PDLSCs 可以在HydM 凝膠上黏附、遷移、存活、增殖和分化成骨，表明HydM是PDLSCs 再生應用可利用的材料。有學者將培養(yǎng)的PDLSCs 誘導成骨并附著在雙相磷酸鈣支架上，然后將附著有PDLSCs 的支架材料移植到犬體內(nèi)。結(jié)果顯示：附著有PDLSCs 的支架材料可促進新生骨形成和新生膠原纖維以直角插入鄰近牙骨質(zhì)和骨，且再生組織有豐富的血管生成，表明PDLSCs 結(jié)合支架材料是牙周組織再生方法中非常有應用前景的方法。

3.2.2 Bio-Oss 顆粒 有研究者構(gòu)建犬牙周炎骨缺損模型，對照組植入Bio-Oss 顆粒，而實驗組則植入等量的載有P3DPSCs 的Bio-Oss 顆粒，結(jié)果表明：兩組均有新牙骨質(zhì)，牙周膜和骨組織的形成，實驗組再生牙骨質(zhì)比對照組的厚，覆蓋了較大的根部表面，而對照組骨質(zhì)較少且分散，表明DPSCs 結(jié)合生物材料能夠再生牙周組織修復牙周缺損。

4 展 望

目前國內(nèi)外研究已經(jīng)證明多種種子細胞可以再生牙周組織，而相關(guān)調(diào)節(jié)因子和支架材料的應用可以促進種子細胞再生牙周組織。將現(xiàn)有的牙周組織再生技術(shù)運用在CAT 再植中，促進牙根周圍及牙槽窩中的牙周組織再生，從而實現(xiàn)CAT 成功再植，為臨床工作提供理論指導。