聚β-羥基丁酸酯來源及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用

楊 靜，白 璐，馬紅麗，王一婷，郭思聰，葉仕根

( 大連海洋大學，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

聚β-羥基丁酸酯(poly-β-hydroxyalkanoates, PHB)是發(fā)現(xiàn)最早的一種聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA)，屬于聚酯類化合物。1925年法國學者Lemoigne首次在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)細胞中發(fā)現(xiàn)分離并提取出了聚β-羥基丁酸酯[1]。聚β-羥基丁酸酯具有熱塑性、組織親和性、光學活性、生物可降解性和生物相容性等多種優(yōu)良特性，同時還可利用再生資源進行生物合成，在工業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領域有廣泛應用[2]。有研究表明，聚β-羥基丁酸酯常在營養(yǎng)不均衡的條件下作為微生物細胞中能量和碳的來源[3]。此外，聚β-羥基丁酸酯可以促進水生動物的生長，提高存活率，抑制致病性弧菌的生長[4]。筆者綜述了聚β-羥基丁酸酯的生物合成與化學合成及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用現(xiàn)狀，并展望了聚β-羥基丁酸酯在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用前景及發(fā)展趨勢。

1 聚β-羥基丁酸酯的來源

聚β-羥基丁酸酯由于其良好特性，在工業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等方面應用廣泛。目前，聚β-羥基丁酸酯主要來源于生物合成和化學合成。

1.1 生物合成與提取

1.1.1 聚β-羥基丁酸酯的生物合成

聚β-羥基丁酸酯的生物合成方式主要有微生物發(fā)酵、活性污泥合成和基因工程手段介導的植物合成等3種方式，其中微生物發(fā)酵是最常見的合成方式?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有300 多種能產(chǎn)生聚β-羥基丁酸酯的微生物，包括光能自養(yǎng)、化能自養(yǎng)和異養(yǎng)菌，但尚未發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生聚β-羥基丁酸酯的真核生物。目前，用于生產(chǎn)的菌種主要是真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenescastellani和A.chalmers)和假單胞菌(Pseudomonas)等[5]。除了微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯以外，還可以采用活性污泥合成聚β-羥基丁酸酯。利用活性污泥生產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯最早是由Satoh等[6]提出，利用活性污泥生產(chǎn)可以降低生產(chǎn)成本，但是合成聚β-羥基丁酸酯含量低，純度不高。Li等[7]研究了在厭氧/好氧間歇式反應器中不同營養(yǎng)條件對聚β-羥基丁酸酯積累的影響，結果表明，氧氣、氮含量、磷含量等對聚β-羥基丁酸酯的積累有影響，好氧條件時，限制氮和磷含量，聚β-羥基丁酸酯積累量可以達到60.4%。同微生物發(fā)酵相比，植物可利用自身豐富的碳源形成具有活性的分子。因此許多研究小組利用基因工程將微生物編碼聚β-羥基丁酸酯合成相關酶導入玉米、棉花、擬南芥、馬鈴薯、煙草、油菜等植物后合成聚β-羥基丁酸酯[8]，降低了生產(chǎn)成本。有研究表明，后期聚β-羥基丁酸酯的大量積累會抑制植物的生長，同時植物生長到后期，聚β-羥基丁酸酯積累能力會減弱[9]。

生物合成對來源菌株要求很高，菌株性能直接影響到后續(xù)聚β-羥基丁酸酯的生產(chǎn)。因此聚β-羥基丁酸酯菌株的篩選以及誘變選育顯得尤為重要。生活污水和污泥是最常見的聚β-羥基丁酸酯菌株的分離來源，已從中分離出芽孢桿菌屬(Bacillus)[10]、假單胞菌屬[11-12]、固氮菌屬(Azotobacter)[13]和腸桿菌屬(Enterobacter)[14]等菌株。土壤也是較為常見的菌株分離來源，已從中分離到的細菌有芽孢桿菌屬[15]、埃希氏菌屬(Escherichia)[16]、假單胞菌屬[17]、紅球菌屬(Mycobacteriumrhodochrous)[18]等。Nazila等[12]自一啤酒廠的廢水出口處分離出6種產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯的細菌，其中產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯最高的菌株為蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。Gabr[15]自土壤樣品中分離到一株以棗椰樹糖漿為碳源且高產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯的芽孢桿菌。雖然已通過試驗篩選獲得很多優(yōu)良的菌株，但是距離生產(chǎn)應用還有一定差距，因此，誘變選育成為一種獲得良好性狀和性能菌株的重要途徑。常用的誘變方法主要有物理誘變和化學誘變兩種類型。物理誘變手段主要有紫外線、超聲波、激光等，化學誘變手段主要采用硫酸二乙酯、亞硝酸等[19]。季愛云[20]采用紫外誘變處理方法對動膠菌(Ramigera)進行了誘變選育，獲得比原始菌株含量高36.84%的突變株。崔曉紅[21]采用紫外線與亞硝酸鈉復合誘變方法獲得聚β-羥基丁酸酯含量高、遺傳較穩(wěn)定的突變株。劉俊梅等[22]采用紫外線和硫酸二乙酯復合誘變選育,聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)量達15.94 g/L的高產(chǎn)菌株?？追嫉萚23]采用常壓室溫等離子體對芽孢桿菌屬菌株進行快速誘變，聚β-羥基丁酸酯含量達77.43%，產(chǎn)量2.78 g/L，是原始菌株的2倍。

1.1.2 生物合成的聚β-羥基丁酸酯的提取

生物合成的聚β-羥基丁酸酯需經(jīng)進一步提取才能獲得應用性的聚β-羥基丁酸酯。聚β-羥基丁酸酯提取方法主要有化學試劑法、物理破壁法、酶降解法等[24]。目前實際生產(chǎn)中一般是將上述方法中的2種或3種結合使用來提高聚β-羥基丁酸酯的提取效率。

化學試劑法是采用有機溶劑、表面活性劑、氧化(或還原劑)和螯合劑等從細胞等物質(zhì)中萃取分離，去除雜質(zhì)，獲得較高純度的聚β-羥基丁酸酯。有機溶劑萃取法是利用聚β-羥基丁酸酯可以溶解于某些有機溶劑不溶于水的特性來分離聚β-羥基丁酸酯。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、1,2-二氯乙烷、1,2-丙烯碳酸鹽和丙酮等[25]。氧化劑(或還原劑)如次氯酸鈉可氧化還原細胞中的物質(zhì)，但聚β-羥基丁酸酯不受影響。鰲合劑可與細胞膜上的鈣鎂離子絡合從而破除細胞壁，釋放聚β-羥基丁酸酯。常用的螯合劑有DTPPA、EDTA等[26]。化學試劑法提取聚β-羥基丁酸酯純度較高，但是在制備過程中使用了大量的有毒或揮發(fā)性溶劑，易造成安全隱患和環(huán)境污染。

物理破壁法采用高壓勻漿法或高速珠研磨法對細胞破壁，釋放出聚β-羥基丁酸酯顆粒。Tamer等[27]比較高壓勻漿法和高速珠研磨法發(fā)現(xiàn)，高壓勻漿法與生物量濃度有關，對聚β-羥基丁酸酯損耗較大。高速珠研磨法能夠減小聚β-羥基丁酸酯的損耗，與生物量濃度無關。物理方法對環(huán)境污染小，但是細胞破壁后聚β-羥基丁酸酯與雜質(zhì)分離較難，因此多數(shù)研究使用物理法破壁后會結合溶劑萃取法等去除雜質(zhì)獲得高純度的聚β-羥基丁酸酯。

酶降解法是利用酶將細胞中除聚β-羥基丁酸酯以外的物質(zhì)降解為可溶性的小分子物質(zhì)從而分離提取聚β-羥基丁酸酯[28]。酶法避免了大量有機溶劑的使用，對環(huán)境污染小，但提取步驟多，聚β-羥基丁酸酯純度不高[26]。

1.2 化學合成

生物合成法合成聚β-羥基丁酸酯的過程中，因其自身的工藝和操作條件等出現(xiàn)了菌株生長周期長、產(chǎn)量低、聚β-羥基丁酸酯提取困難等問題，導致聚β-羥基丁酸酯生產(chǎn)成本較高。因此，化學法合成聚β-羥基丁酸酯是開發(fā)生產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯的另一條途徑?；瘜W合成通常是在制備不同單體基礎上經(jīng)過不同方法聚合來生產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯。常見單體有β-丁內(nèi)酯、3-羥基丁酸乙酯和3-羥基丁酸。有研究發(fā)現(xiàn)，采用3-羥基丁酸乙酯、3-羥基丁酸兩種單體縮合聚合可以制備較低分子量的聚β-羥基丁酸酯。由于縮合聚合時3-羥基丁酸乙酯和3-羥基丁酸兩種單體會產(chǎn)生單官能團的物質(zhì)，阻止相對分子質(zhì)量的提高，因此，利用這兩種單體難以制備相對分子質(zhì)量較高的聚β-羥基丁酸酯。采用β-丁內(nèi)酯開環(huán)聚合可以制備具有一定構型且相對分子量較高的聚β-羥基丁酸酯[29]。Seebach等[30]提出了以3-羥基丁酸為原料制備聚β-羥基丁酸酯，利用酸—氯偶聯(lián)反應保護羥基和羧基、一步聚合后分別去除t -丁酯保護基團和苯醚保護基團，最后進行后耦合程序這4個反應，結果表明聚合物的聚合度只能達到3。楊文超[31]通過鈦酸四丁酯催化3-羥基丁酸乙酯以熔融縮聚的方式獲得聚β-羥基丁酸酯。Ebrahimi等[32]以二氨基酚鹽配體為載體的鋅配合物催化β-丁內(nèi)酯發(fā)生聚合反應，獲得了高分子量的聚β-羥基丁酸酯。采用化學合成法制備聚β-羥基丁酸酯可以提高聚β-羥基丁酸酯的產(chǎn)量，但是制備過程較為復雜，反應條件較為苛刻，副反應較多，易對環(huán)境造成二次污染。

2 聚β-羥基丁酸酯在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用

聚β-羥基丁酸酯由于其良好特性，在工業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領域有廣泛應用。Defoirdt等[33]等研究了聚β-羥基丁酸酯保護鹵蟲抵抗致病性弧菌的影響，這是聚β-羥基丁酸酯應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的首次報道。此后，在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[34]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[35]、歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[36]、貽貝[37]和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[38]等水產(chǎn)動物上陸續(xù)進行了新的研究并取得較好效果。段亞飛等[39]報道了聚β-羥基丁酸酯在水產(chǎn)動物中的應用研究概況。筆者在此基礎上對聚β-羥基丁酸酯在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用研究的最新進展進行了進一步總結。目前看來，聚β-羥基丁酸酯在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用作用主要體現(xiàn)在促進水產(chǎn)動物生長，增強免疫和水質(zhì)調(diào)控3個方面。

2.1 促進生長

段亞飛等[39]綜述了聚β-羥基丁酸酯對中華絨螯蟹、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)和西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)等水生動物生長性能的影響，認為聚β-羥基丁酸酯能夠改善動物消化酶活性，增加腸道消化吸收的表面積，從而促進動物生長。Silva等[40]研究了聚β-羥基丁酸酯對凡納濱對蝦腸道組織、消化酶活性和營養(yǎng)消化率的影響，發(fā)現(xiàn)試驗組腸道淀粉酶、蛋白酶、胰蛋白酶活性均升高，脂類和多糖消化率提高，腸絨毛長度和寬度增加，表明聚β-羥基丁酸酯能夠提高消化酶活性的表達，增加腸道消化吸收的表面積，提高凡納濱對蝦的消化吸收能力，進而促進動物生長。Duan等[41]也發(fā)現(xiàn)聚β-羥基丁酸酯能夠增加腸上皮細胞的高度，促進腸道消化吸收，且最適添加量為3%。

聚β-羥基丁酸酯可以在動物腸道中降解成短鏈脂肪酸，降低腸道pH[42]，促進有益菌的增殖[39]，影響腸道微生物的豐富度和多樣性[43-44]，提高動物的質(zhì)量增加率和特定生長率[45]，進而促進動物的生長。此外，飼喂時間對于動物腸道微生物菌群豐富度也有一定的調(diào)節(jié)作用[46]。Duan等[47]研究發(fā)現(xiàn)，隨著聚β-羥基丁酸酯含量的升高，凡納濱對蝦腸道微生物多樣性降低，腸道中芽孢桿菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus)等有益菌的菌群豐度提高。Gao等[48]研究與之相似，發(fā)現(xiàn)可以大量積累聚β-羥基丁酸酯的鹽單胞菌不僅可以抑制凡納濱對蝦腸道微生物弧菌的增殖，還能促進芽孢桿菌和乳酸桿菌等有益菌的增殖。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，β-羥基丁酸單體可以作用于腸道上皮細胞，誘導細胞分化，促進個體生長和脂肪酸積累，進而影響產(chǎn)卵和孵化[49]。張恒恒等[49]研究了聚β-羥基丁酸酯對中國明對蝦親蝦繁殖性能和幼體發(fā)育的影響，結果發(fā)現(xiàn)，添加量為2%時，對蝦親蝦終末體質(zhì)量、質(zhì)量增加率、特定生長率、產(chǎn)卵量和無節(jié)幼體數(shù)量均高于對照組，結果表明，飼料中添加聚β-羥基丁酸酯能夠促進中國明對蝦親蝦的繁殖性能和幼體發(fā)育。

2.2 增強抗病力

聚β-羥基丁酸酯可以激活動物的免疫系統(tǒng)，提高非特異性免疫能力，抑制病原微生物的生長，增強機體抵抗力。聚β-羥基丁酸酯能夠改善中國明對蝦、歐洲舌齒鱸和西伯利亞鱘等水產(chǎn)動物的免疫功能，通過誘導非特異性免疫基因的表達，激活動物的免疫系統(tǒng)，來提高非特異性免疫能力[39]。Laranja等[50]采用富含聚β-羥基丁酸酯的芽孢桿菌投喂斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)幼蝦后，發(fā)現(xiàn)聚β-羥基丁酸酯積累的芽孢桿菌能夠刺激對蝦的天然免疫相關基因，特別是proPO和TGase基因。在弧菌攻毒后，各組對蝦HSP 70表達均顯著升高。聚β-羥基丁酸酯能夠提高免疫酶活性，增強動物的抗病力。張恒恒等[51]研究了不同含量聚β-羥基丁酸酯對中國明對蝦非特異性免疫酶的影響，結果發(fā)現(xiàn)，聚β-羥基丁酸酯添加量為1%時，總抗氧化能力、酸性磷酸酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶5種酶活力與對照組差異顯著(P<0.05)，說明聚β-羥基丁酸酯能夠提高中國明對蝦的免疫水平，最適添加量為1%。Duan等[41]的研究與之相似，總抗氧化能力和溶菌酶活性升高，Toll 基因和HSP70 基因表達上調(diào)，表明聚β-羥基丁酸酯能夠增強凡納濱對蝦的非特異免疫能力。此外，聚β-羥基丁酸酯能夠提高抗菌肽的表達，增強動物的抗病力。Franke等[36]研究了聚β-羥基丁酸酯對歐洲鱸魚幼魚免疫刺激的影響。結果表明，聚β-羥基丁酸酯能夠刺激魚類早期階段的免疫系統(tǒng)，提高抗菌肽dicentracin、Hepcidin、mhc class Ⅱa和mhc class Ⅱb的表達水平，推測這可能是聚β-羥基丁酸酯可以增強抵抗力和提高存活率的原因。Hung等[52]的研究與之相似，采用溶珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)攻毒后，發(fā)現(xiàn)酚氧化酶活性升高，4種抗菌肽基因的表達量均上調(diào)，表明聚β-羥基丁酸酯能夠增強紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)的抗病力。聚β-羥基丁酸酯能夠降低腸道pH，抑制病原微生物的生長[39]，增強機體抵抗力。Nhan等[53]研究了聚β-羥基丁酸酯對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的影響，結果發(fā)現(xiàn)，聚β-羥基丁酸酯可以抑制潛在病原微生物的生長，提高羅氏沼蝦存活率。Ludevese-Pascual等[54]研究了聚β-羥基丁酸酯對斑節(jié)對蝦的影響，使用坎氏弧菌(V.campbellii)攻毒后，發(fā)現(xiàn)投喂強化后的鹵蟲累計死亡率較對照組減小了35%。Sui等[38]的研究與之相似，添加聚β-羥基丁酸酯的中華絨螯蟹溞狀幼體的存活率較對照組高出14%，同時使用鰻弧菌(V.anguillarum)攻毒后繼續(xù)投喂，其存活率較對照組高出12.2%。Hung等[52]研究了聚β-羥基丁酸酯對紫貽貝的影響，發(fā)現(xiàn)在使用溶珊瑚弧菌(V.coralliilytius)攻毒后，其存活率高出對照組12%。Defoirdt等[55]研究了聚β-羥基丁酸酯對弧菌毒力因子的影響，結果表明，聚β-羥基丁酸酯通過降低弧菌溶血素、磷脂酶和蛋白酶等不同毒力因子的產(chǎn)生，抑制菌株的毒力，從而提高動物的存活率。

2.3 調(diào)控水質(zhì)

聚β-羥基丁酸酯是菌株在去除污染物過程中所需碳源和能量的中轉站[56]，是活性污泥除磷、脫氮過程中主要的碳源和能量源[57]。

Kuba等[58]研究發(fā)現(xiàn)，反硝化聚磷菌和好氧聚磷菌聚磷作用機理較為相似，在厭氧條件下，細菌利用多聚磷酸鹽吸收有機酸在細胞中形成聚β-羥基丁酸酯，并將多余的磷酸鹽釋放，在好氧條件下，細菌氧化聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)生能量，將過量攝取的磷酸鹽儲存在細胞中。田淑媛等[59]研究了在厭氧條件下，聚β-羥基丁酸酯的合成與聚磷酸鹽釋放二者之間的關系，其結果與之相似，同時發(fā)現(xiàn)聚β-羥基丁酸酯的合成與化學需氧量的去除正相關。鄭宗林等[11]利用反硝化聚磷菌的聚磷作用機理，在底泥中篩選出一株具有合成聚β-羥基丁酸和多磷酸鹽的反硝化聚磷菌。進一步表明污泥廢水高效去磷的主要原因是在厭氧條件下大量合成聚β-羥基丁酸酯和好氧條件下聚磷菌大量吸收磷酸鹽。此外，污泥轉移量對胞內(nèi)聚合物聚β-羥基丁酸酯的合成有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，過量的污泥轉移會降低聚β-羥基丁酸酯的合成，促進糖原的合成，降低磷的去除率[60]。在適當?shù)奈勰噢D移比下，活性污泥可以合成足夠的聚β-羥基丁酸酯，提高除磷能力，從而更好的進行水質(zhì)調(diào)控。鄧猛等[61]研究了當污泥轉移量為15%、30%、40%時厭氧釋磷和好氧吸磷的情況，結果表明，聚β-羥基丁酸酯的合成與磷的釋放趨勢相同。污泥轉移量為30%時除磷效果最好，去除率為96.7%。

聶毅磊等[62]對兩株可以大量產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯的好氧反硝化菌和復合菌水質(zhì)凈化的能力進行研究，結果表明，40 h內(nèi)總氮去除率分別為 9.20%、17.16% 和 32.84%，復合菌比單菌脫氮效果更好。Ruan等[63]將生物絮凝技術結合序批式間歇活性污泥法研究了不同氧氣條件下養(yǎng)殖廢水絮凝體對聚β-羥基丁酸酯富集的影響，優(yōu)化絮凝體生物量、厭氧培養(yǎng)時間等條件后，發(fā)現(xiàn)在可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用能夠適當積累聚β-羥基丁酸酯的生物絮團，可以增加潛在的益生元價值，提高氮的去除率。Ludevese-Pascual等[64]研究了以聚β-羥基丁酸酯為基礎的人工基質(zhì)在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中對水質(zhì)的影響，在72 h后，發(fā)現(xiàn)使用聚β-羥基丁酸酯基質(zhì)的試驗組總氨氮含量為(0.35±0.04) mg/L,不使用基質(zhì)總氨氮含量為(1.28±0.06) mg/L和使用PVC基質(zhì)的總氨氮含量為(1.23±0.10) mg/L，表明以聚β-羥基丁酸酯為基礎的人工基質(zhì)可以顯著降低凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的總氨氮含量，從而保持良好水質(zhì)。

3 展 望

聚β-羥基丁酸酯是一種重要的聚酯類化合物，廣泛應用于工業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領域，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也表現(xiàn)出較好應用效果。目前，已有研究證實，聚β-羥基丁酸酯可以抑制病原微生物生長，增強動物非特異性免疫能力，提高免疫酶活性，但增強免疫作用和提高抗病的詳細機制仍不明確，還需進一步探索。此外，聚β-羥基丁酸酯在水產(chǎn)動物應用研究較少，其在不同物種使用效果、作用機制、使用時間、最適添加量等研究尚不明確，是下一步需關注的重點。其次，聚β-羥基丁酸酯是活性污泥除磷脫氮過程中主要的碳源和能量源，因此培養(yǎng)大量積累聚β-羥基丁酸酯的反硝化聚磷菌為主體的高效菌株，結合生物絮團工藝應用在廢水處理中也許是一個新的研究熱點。最后，在聚β-羥基丁酸酯生產(chǎn)方面，雖然目前聚β-羥基丁酸酯已能較大規(guī)模生產(chǎn)，但是還存在菌株聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)量較低，合成成本較高等問題，有必要進一步加強菌株的篩選和誘變選育工作，優(yōu)化生物合成產(chǎn)生工藝，從而進一步提高聚β-羥基丁酸酯產(chǎn)量，降低成本。