鹿科動(dòng)物染色體研究進(jìn)展

唐麗昕，張然然，董世武，邢秀梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112）

我國鹿類資源豐富，共有21 種，占全球的41.7%[1]。其中，鹿科動(dòng)物屬于哺乳綱偶蹄目，因其是名貴的藥用動(dòng)物而具有很高的研究價(jià)值。

染色體是細(xì)胞核內(nèi)主要遺傳物質(zhì)的載體，它可以儲(chǔ)存和運(yùn)輸DNA。染色體的變異包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異。染色體數(shù)目變異，指染色體整倍性和非整倍性變異。染色體結(jié)構(gòu)變異則包括染色體片段的重復(fù)、缺失、倒位以及易位[2]。而染色體任何數(shù)目和結(jié)構(gòu)上的變化都可能引起物種遺傳變異的發(fā)生。染色體的這種變異也是生物多樣性的主要來源之一。染色體研究無論對于了解物種的進(jìn)化起源問題，還是研究新物種的形成，都有重要的意義[3]。對染色體的研究方法包括核型、帶型分析以及結(jié)合微陣列分析[4]，熒光原位雜交[5]技術(shù)等。而鹿科動(dòng)物已有的染色體研究普遍是核型和帶型的。本文擬對近些年來鹿科動(dòng)物染色體的相關(guān)研究方法以及研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 鹿科動(dòng)物染色體核型研究

核型又稱染色體組型，是染色體形態(tài)學(xué)上的概念，指染色體的形態(tài)特征、大小及數(shù)目的總和。每種生物都有其特定的一套染色體核型。一般情況下，一個(gè)體細(xì)胞的染色體核型就可以代表個(gè)體的染色體特征。對物種染色體核型的觀察可以得到染色體的基本形態(tài)學(xué)特征。同時(shí)，通過對物種間染色體核型的觀察與比較，可以觀察出物種在染色體核型上的特異性[6]。染色體核型的研究為進(jìn)一步的分子細(xì)胞生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

鹿科動(dòng)物的進(jìn)化起源問題一直都存在著一些爭議，尤其是梅花鹿和馬鹿之間進(jìn)化起源的先后問題。針對這一問題，僅從物種性狀特征的進(jìn)化以及地理分布變化方面進(jìn)行研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。染色體核型的研究對于解決物種分類及進(jìn)化起源問題是十分有必要的。一方面，可以從染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)發(fā)生的差異來探尋鹿科動(dòng)物染色體發(fā)生變異的主要機(jī)制；另一方面，可以從細(xì)胞遺傳學(xué)角度為鹿科動(dòng)物的分類及進(jìn)化起源問題的后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)和參考。

在國外，很早就有學(xué)者對一些鹿科動(dòng)物的染色體核型做過相關(guān)研究。自20 世紀(jì)60 年代開始，國內(nèi)外就有鹿科動(dòng)物染色體相關(guān)的研究報(bào)道。1963 年，Benirschke等[7]報(bào)道了弗吉尼亞白尾鹿的二倍體染色體數(shù)目為70。Gustavsson 等[8]報(bào)道了5 種鹿科動(dòng)物的二倍體染色體數(shù)目，駝鹿（Alces alces）為 68，狍（Capreolus capreolus）為 70，馬鹿（Cervus elaphus）為 68，梅花鹿（Cervus nippon）為 67，黇鹿（Dama dama）為 68。

1.1 梅花鹿染色體核型研究

梅花鹿是國家一級保護(hù)動(dòng)物，已被列入《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》，很多學(xué)者都對其染色體的核型進(jìn)行了研究。國外學(xué)者Gustavsson 等[9-10]報(bào)道了東北梅花鹿染色體數(shù)2n=64，68；日本梅花鹿染色體數(shù)目2n=66，67。而國內(nèi)俞秀璋等[11]、王宗仁等[12]均通過試驗(yàn)得出東北梅花鹿染色體存在多態(tài)性2n=64 68。王宗仁等[13-14]報(bào)道，日本梅花鹿染色體數(shù)目的多態(tài)性2n=66 68。同時(shí)，通過將東北梅花鹿、東北馬鹿和中亞馬鹿的染色體核型作比較分析得出，雖然中亞馬鹿是馬鹿的一個(gè)亞種，但其與東北馬鹿的染色體數(shù)目有差異，而與東北梅花鹿的相似，很可能是因?yàn)橹衼嗰R鹿較其他馬鹿在進(jìn)化上起源較早、比較接近于梅花鹿。祁得林[15]對青海地區(qū)梅花鹿染色體核型的研究證明，梅花鹿的染色體數(shù)2n=64 66，68，存在多態(tài)現(xiàn)象。梅花鹿染色體的多態(tài)現(xiàn)象，不僅存在于亞種之間，還存在于同一亞種的不同個(gè)體間，而這種多態(tài)現(xiàn)象可能與不同類型染色體數(shù)目的差異有關(guān)。

1.2 馬鹿染色體核型研究

馬鹿是大型鹿科動(dòng)物，因其體型大、產(chǎn)茸量高而具有較大的研究價(jià)值。我國馬鹿主要分布在西北，新疆地區(qū)，東北地區(qū)也有分布。王宗仁等[12,14]分別研究了中亞馬鹿和東北馬鹿的染色體核型，中亞馬鹿的染色體數(shù)目為2n=66、67，存在多態(tài)現(xiàn)象，而東北馬鹿染色體數(shù)目2n=68，并不存在多態(tài)現(xiàn)象。王宗仁等[13]也得出青鹿、東北馬鹿染色體數(shù)目為2n=68，青鹿和東北馬鹿的染色體組型一致，這就為將這2 個(gè)馬鹿亞種并為1 個(gè)亞種提供了依據(jù)。另外，李軍祥等[16]對青海地區(qū)的馬鹿染色體核型進(jìn)行了分析，得出染色體數(shù)2n=68。馬鹿染色體存在多態(tài)性可能是因?yàn)闇p數(shù)分裂過程中配子隨機(jī)結(jié)合。

1.3 駝鹿染色體核型研究

國外對駝鹿的研究比較早，Aula 等[17]在1964 年首次對歐洲駝鹿（A.a.alces）進(jìn)行了核型研究，得到歐洲駝鹿染色體數(shù)是2n=68。隨后，Hsu等[18]對西氏駝鹿（A.a.shirasi）和北美東部駝鹿（A.a.americana）進(jìn)行了核型研究，得到這2 個(gè)亞種的染色體數(shù)是2n=70。而國內(nèi)，卜令浩[19]對遠(yuǎn)東駝鹿的染色體核型進(jìn)行了觀察，其染色體數(shù)目是2n=68。將這3 個(gè)駝鹿亞種染色體核型的研究結(jié)果進(jìn)行綜合分析，得出遠(yuǎn)東馬鹿與歐洲馬鹿因核型相似而在親緣關(guān)系上也更近。

1.4 其他鹿科動(dòng)物染色體核型研究

還有一些其他鹿科動(dòng)物的染色體核型研究，Miyake等[20]對蝦夷鹿染色體核型研究發(fā)現(xiàn)，其核型不存在多態(tài)性。段幸生等[21]研究結(jié)果表明，黑麂的染色體數(shù)目（雄）2n=9，（雌）2n=8。毛冠鹿是分布在我國南方地區(qū)的珍稀鹿種。1983 年，張錫然等[22]首次報(bào)道了毛冠鹿的雌性核型（2n=47）和雄性核型（2n=48）。隨后，王宗仁等[23]發(fā)現(xiàn)毛冠鹿染色體眾數(shù)是2n=46?？讈喕鄣萚24]則發(fā)現(xiàn)毛冠鹿核型存在多態(tài)現(xiàn)象，證明了毛冠鹿有4 種核型。粘偉紅等[25]首次發(fā)現(xiàn)在毛冠鹿染色體中存在2 條異型的X染色體。王宗仁等[14]將爪哇鹿與云南黑鹿的染色體核型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其染色體的核型、帶型都很相似，確定了爪哇鹿和黑鹿是親緣關(guān)系非常近的一個(gè)種。

1.5 雜交鹿染色體核型的研究

除了對純種鹿染色體核型的研究外，還有一些對雜交鹿染色體核型的相關(guān)研究。方元等[27]研究并報(bào)道了云南水鹿和東北梅花鹿雜交鹿（F1）的染色體組型。雜交鹿（F1）的染色體數(shù)為2n=64。俞秀璋等[28-29]對赤鹿和梅花鹿的雜交后代進(jìn)行了核型分析，初步表明其染色體數(shù)雌雄均為2n=67，此外，還對東北梅花鹿和東北馬鹿的雜交后代進(jìn)行了核型研究，發(fā)現(xiàn)雜交后代染色體數(shù)目為2n=66 68，而且染色體數(shù)目為2n=67 的雜交鹿是可育的核型。

1.6 鹿科動(dòng)物染色體核型進(jìn)化機(jī)制

王宗仁[26]通過將自已與前人的研究結(jié)合起來對鹿科動(dòng)物染色體核型進(jìn)行比較歸納，總結(jié)得出染色體變異的機(jī)制：鹿科動(dòng)物染色體的變異主要是常染色體數(shù)目的變化。引起染色體數(shù)目發(fā)生變化的機(jī)制主要是羅伯遜斷裂（即1 條中心著絲粒染色體斷裂，形成2 條端著絲粒染色體）。

2 鹿科動(dòng)物染色體顯帶技術(shù)

對于鹿科動(dòng)物染色體的研究，常規(guī)的核型研究一直是不可忽視的。但是，隨著鹿科動(dòng)物染色體研究的不斷深入，越來越多的學(xué)者嘗試著將一些相對成熟的哺乳動(dòng)物染色體研究技術(shù)應(yīng)用于鹿科動(dòng)物染色體的研究中，其中就包括染色體顯帶技術(shù)。染色體顯帶技術(shù)使染色體的研究更加深入，其不僅可以顯示種內(nèi)的染色體分化，而且能揭示許多核型研究不能顯示的種間差異[30]。染色體的帶型主要包括 G 帶、C 帶、Q 帶、R 帶以及銀染Ag-NORs（N帶）等。而對鹿科動(dòng)物染色體帶型的分析，G 帶、C 帶、R 帶以及銀染 Ag-NORs 的研究效果比較理想。Q帶在鹿科動(dòng)物染色體研究的文章并不多見。染色體顯帶技術(shù)及對其帶型的分析成為研究鹿科動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)的又一重要方法。

2.1 G帶

G帶分析是染色體顯帶分析中應(yīng)用最廣泛的顯帶技術(shù)。將制備好的染色體標(biāo)本用堿、胰蛋白酶或其他鹽溶液處理后，再使用Giemsa 染液染色，在普通顯微鏡下，可見深淺相間的帶紋，稱G 帶（G band）。在G 帶分析中，每條染色體均有其特定的帶型特征，G帶暗紋區(qū)富含A-T 堿基對，亮帶區(qū)則富含G-C 堿基對，深淺條紋交替排列在染色體上[31]。通過對于G 帶的分析，可以得出染色體具體的類型、數(shù)目，以及相關(guān)的帶紋特征信息。俞秀璋等[32]通過對東北梅花鹿G帶的觀察得出結(jié)論：確認(rèn)東北梅花鹿染色體數(shù)2n=66，個(gè)體間染色體數(shù)不存在多態(tài)現(xiàn)象，但在同一個(gè)體內(nèi)細(xì)胞染色體數(shù)有差異。王宗仁等[33]對白唇鹿的染色體G 帶觀察發(fā)現(xiàn)，白唇鹿在染色體數(shù)目及形態(tài)上都和東北梅花鹿十分相似且染色體類型相同。

2.2 C帶

C 帶是組成異染色質(zhì)帶的簡稱。C 帶是用堿性溶液〔飽和Ba（OH）2溶液〕處理制片標(biāo)本，再使用Giemsa染液染色得到的帶型。染色體的C 帶分析多用于染色體的多態(tài)分析，顯示的是染色體全部的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)域、次縊痕位置以及 Y 染色體。深染色的區(qū)域是DNA重復(fù)序列。這種顯帶方法特別適合于染色體的著絲粒區(qū)和Y染色體長臂的觀察。段幸生等[21]通過對黑麂 C 帶的研究發(fā)現(xiàn)其染色體著絲點(diǎn)區(qū)特別長且異染色質(zhì)非常豐富，但異染色質(zhì)的短臂長短有異，存在多態(tài)現(xiàn)象。粘偉紅等[25]對毛冠鹿C 帶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)毛冠鹿異染色質(zhì)的分布和含量存在差異會(huì)導(dǎo)致染色體產(chǎn)生多態(tài)現(xiàn)象：常染色體上異染色質(zhì)分布不均勻使得同源染色體產(chǎn)生差別，而在性染色體上因?yàn)楫惾旧|(zhì)含量不同，染色體大小產(chǎn)生明顯差別。

2.3 R帶

R 帶是G 帶的反帶，在G 帶呈深帶的區(qū)域，R 帶呈現(xiàn)的就是淺帶。R帶是用熱鹽處理制片標(biāo)本，再使用Giemsa 染液染色，得到與G 帶帶型相反的帶紋。R 帶的顯帶技術(shù)主要用來研究染色體末端發(fā)生的異常，如缺失和重排。而鹿科動(dòng)物方面，蔣德梅[34]通過試驗(yàn)得到東北梅花鹿R 帶模式圖，并將其與已有的鹿科動(dòng)物的染色體R 帶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了在染色體的壓縮層面上，同一物種的相似性和穩(wěn)定性以及同一物種不同亞種間的差異性。

2.4 N帶

N 帶又稱銀染Ag-NORs 顯帶，是在高溫條件下，用三氯醋酸處理制片標(biāo)本，再在溫育后用Giemsa染液染色得到的核仁組織區(qū)深染，其他部分淺染的帶型。N帶顯帶技術(shù)主要用來對結(jié)構(gòu)上的非組蛋白的蛋白質(zhì)和核仁組織區(qū)特異性結(jié)合的地方進(jìn)行識(shí)別和分析。Ag-NORs 是隨染色體而遺傳的，可作為品種特征的遺傳標(biāo)記之一，用于研究品種間的差異，以探討品種的起源進(jìn)化。在家豬[35-36]上已有報(bào)道Ag-NORs，不但有品種和個(gè)體差異，而且與豬的起源進(jìn)化有關(guān)。而鹿科動(dòng)物中，韓莉[37]觀察發(fā)現(xiàn)Ag-NORs 主要位于染色體的著絲粒位置，說明東北梅花鹿的異染色質(zhì)主要以著絲粒帶的形式出現(xiàn)，通過與C 帶比較，說明東北梅花鹿染色體在亞種水平上可能存在異染色質(zhì)多態(tài)性。

2.5 其他

另外，還有一些其他的研究，例如染色體的高分辨顯帶，限制性內(nèi)切酶顯帶等。高分辨染色體，是指通過某種處理，獲得有絲分裂早期染色體的分裂相，顯帶后可得到更多更細(xì)的帶紋，從而提高了人類對染色體的分辨力[38]。趙婉婷等[39]通過試驗(yàn)得出單套染色體共顯帶456 條，并以此為基礎(chǔ)，繪制了梅花鹿高分辨G 帶模式圖。而限制性內(nèi)切酶顯帶技術(shù)因其可對原位固定的染色體誘導(dǎo)顯帶，并可從光鏡和電鏡多個(gè)角度對染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，被廣泛應(yīng)用于真核生物中。蔣德梅等[40]采用限制性內(nèi)切酶Hae Ⅲ和Hind Ⅲ分別處理東北梅花鹿中期染色體標(biāo)本，得到了類似G 帶和C 帶，同時(shí)得出了12 對常染色體和1 對性染色體具有異質(zhì)性。

3 熒光原位雜交技術(shù)在動(dòng)物染色體研究中的應(yīng)用

熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)可以鑒別特異性序列，染色體亞區(qū)，或整個(gè)基因組；可以特別地突出中期或間期細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目。該技術(shù)可用于識(shí)別染色體，檢測染色體異?；虼_定特定序列的染色體位置。FISH 在細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷、腫瘤生物學(xué)、基因擴(kuò)增和基因定位等諸多研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[41]。其原理是將特定的DNA探針用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，再將標(biāo)記后的探針與靶DNA進(jìn)行原位雜交，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對靶DNA 進(jìn)行定性、定量或相對定位分析[42]。染色體異常包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常，而大部分?jǐn)?shù)目的異常都會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。單單采用染色體顯帶分析并不能解決所有的染色體異常問題，而采用熒光原位雜交技術(shù)能很好地解決[43]。丁銀潤[44]采用熒光原位雜交技術(shù)直接檢測出昆明山海棠水抽提物（THH）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中作用產(chǎn)生的非整倍體。Bonnet-Garnier A[45]利用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)，采用牛和山羊的BAC 探針，驗(yàn)證了13 個(gè)通過普通的R 帶顯帶分析得不出的羅伯遜易位。

4 小結(jié)與展望

染色體的研究在對了解生物的遺傳變異、系統(tǒng)演化、性別決定、個(gè)體發(fā)育和生理過程的平衡和控制等方面都有重要作用，染色體分析已經(jīng)是細(xì)胞遺傳學(xué)必不可少的重要環(huán)節(jié)[25]。

鹿科動(dòng)物種類繁多，且經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。對于鹿科動(dòng)物染色體，最集中的研究時(shí)間是20 世紀(jì)80～90 年代，主要是在細(xì)胞水平上的研究，借助顯微鏡來觀察各鹿科動(dòng)物及其雜交后代的染色體核型及其不同種類的顯帶分析。細(xì)胞遺傳學(xué)的核型和顯帶分析已經(jīng)研究得十分深入。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，針對染色體的研究從細(xì)胞遺傳學(xué)深入到分子細(xì)胞遺傳學(xué)。我們對于鹿科動(dòng)物染色體的研究不能僅僅局限于細(xì)胞水平上核型以及顯帶分析，應(yīng)該在此基礎(chǔ)上拓展新的、更具意義的研究領(lǐng)域。可以把基本的染色體核型研究與現(xiàn)代先進(jìn)的生物技術(shù)以及生物信息學(xué)相結(jié)合，將染色體進(jìn)行深度剖析，逐步獲得基因在染色體上的定位，一方面，將不同鹿科動(dòng)物同一位置染色體上的序列進(jìn)行比對，從而解釋鹿科動(dòng)物中不同物種，甚至亞種間的差異。另一方面，將細(xì)胞遺傳學(xué)研究轉(zhuǎn)向基因組學(xué)研究，從基因組學(xué)的水平上研究鹿科動(dòng)物染色體與基因以及基因?qū)?yīng)的生物重要性狀的關(guān)系，將鹿科動(dòng)物染色體的研究帶入到一個(gè)全新的基因組學(xué)時(shí)代。