MicroRNA在特發(fā)性肺纖維化中作用的研究進(jìn)展

宋旭東，吳 丹，于 洋，陳培劍，初彥輝

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是最常見和最嚴(yán)重的間質(zhì)性肺疾病，IPF以彌漫性肺泡炎、肺成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞大量增殖活化以及細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積為主要特征，最終導(dǎo)致患者肺間質(zhì)逐漸瘢痕化并出現(xiàn)進(jìn)行性的呼吸衰竭[1]。IPF被認(rèn)為是年齡相關(guān)性疾病，患者的年齡普遍在60歲以上，且大多數(shù)為男性，在沒有進(jìn)行肺移植手術(shù)的情況下，患者從診斷之日起中位生存期約為3到5年[2]。

1 特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機(jī)制

IPF是一種原因不明的多因素疾病，目前普遍認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，胃食管反流，煙草煙霧吸入以及金屬粉塵、木屑、有機(jī)粉塵、二氧化硅粉塵的吸入等都有利于增加IPF的患病率。IPF的發(fā)病涉及創(chuàng)傷修復(fù)多個(gè)通路的異常激活，而肺泡上皮出現(xiàn)損傷和異常修復(fù)被認(rèn)為是肺纖維化的初始過程[1]。IPF的發(fā)生和發(fā)展可分為三個(gè)階段。第一個(gè)階段是啟始階段，個(gè)體的基因變異或突變，導(dǎo)致個(gè)體容易患病；此外長期暴露于微損傷環(huán)境，如煙草煙霧，病毒感染等，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體出現(xiàn)肺上皮細(xì)胞損傷和異常修復(fù)，同時(shí)導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致疾病進(jìn)一步發(fā)展。第二階段是發(fā)展階段，導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能障礙的多種因素，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，生長因子和炎性因子過量分泌等，促使發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，炎性細(xì)胞向損傷部位聚集，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖和活化。第三個(gè)階段是病理階段，在這個(gè)階段下成纖維細(xì)胞在與微損傷環(huán)境的反復(fù)作用下出現(xiàn)大量增殖活化，最終形成成纖維細(xì)胞灶，并且分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺間質(zhì)中膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。以上三個(gè)階段的重復(fù)出現(xiàn)，最終導(dǎo)致肺組織逐漸瘢痕化，形成肺纖維化病變?cè)睢?/p>

2 MicroRNA和特發(fā)性纖維化

2.1 MicroRNA的生物學(xué)特征MicroRNA(miRNA)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA，其長度大小約為19到25個(gè)核苷酸。目前，在人體中已鑒定發(fā)現(xiàn)700多個(gè)miRNAs，并且人類基因組可以產(chǎn)生miRNA的位置超過2000處。miRNA參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，單個(gè)miRNA可以靶向作用于數(shù)百個(gè)mRNA,并影響許多基因的表達(dá)。miRNA在多種細(xì)胞和生理活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用，大量證據(jù)表明miRNA和多種人類疾病相關(guān)，如心血管疾病，腎臟疾病，癌癥等[3]。

2.2 MicroRNA和IPF的相關(guān)性許多研究表明，miRNA參與IPF的發(fā)病機(jī)制。例如，Huang等[4]發(fā)現(xiàn)無論是IPF患者還是博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，miR-101表達(dá)均下降，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-101可通過抑制成纖維細(xì)胞的增殖和活化減輕肺纖維化。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-21在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中升高，并且抑制miR-21表達(dá)可以減輕TGF-β誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，這說明miR-21可能通過促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變而參與肺纖維化發(fā)展過程[5]。

3 MicroRNA在IPF發(fā)病機(jī)制中的作用

3.1 MicroRNA和肺上皮細(xì)胞凋亡在正常的肺組織修復(fù)過程中，當(dāng)Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖，對(duì)損傷的部位進(jìn)行修復(fù)。在IPF的肺組織中，由于肺上皮細(xì)胞的功能障礙，難以完成對(duì)損傷部位的正常修復(fù)，致使疾病進(jìn)一步發(fā)展。因此，肺上皮損傷作為肺纖維化的初始過程，干預(yù)此過程對(duì)預(yù)防肺纖維化具有重要意義。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡是IPF發(fā)生和發(fā)展的重要因素。在博來霉素誘導(dǎo)的IPF小鼠體內(nèi)miR-30a出現(xiàn)明顯下調(diào)，Mao等人[6]發(fā)現(xiàn)miR-30a過表達(dá)可以抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過阻斷依賴于Drp-1的線粒體分裂。作為甲基胞嘧啶雙加氧酶家族(ten-eleven translocation family)重要的成員的TET1基因是miR-30a的靶點(diǎn)之一，miR-30a可以靶向作用于TET1降低其表達(dá)。有研究證明TET1 siRNA可以抑制Drp-1啟動(dòng)子羥甲基化[7]。綜前所述，miR-30a可以靶向與TET1的3′-UTR結(jié)合而抑制其表達(dá)，進(jìn)而干擾Drp-1啟動(dòng)子羥甲基化而參與IPF發(fā)展過程。與幼齡的小鼠相比，老齡的小鼠肺上皮細(xì)胞中的miR-34a表達(dá)明顯上升，并且這種上升在博來霉素處理的老齡小鼠的肺中更為顯著。miR-34a的上調(diào)可以加速肺上皮細(xì)胞的衰老、凋亡和線粒體損傷，導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能障礙，從而促進(jìn)了老齡小鼠的肺纖維化。p53是重要的細(xì)胞衰老標(biāo)志物之一，Shetty等[8]發(fā)現(xiàn)在不同因素誘導(dǎo)的肺上皮損傷和IPF模型中，miR-34a和p53乙?；磉_(dá)均增強(qiáng)，同時(shí)伴隨著沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)表達(dá)降低,SIRT1是煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶,可使多種蛋白的賴氨酸殘基脫去乙?；Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)抑制miR-34a可以促進(jìn)Sirt1的表達(dá)增多，過表達(dá)的Sirt1可以降低p53乙酰化的水平，從而達(dá)到減緩肺上皮細(xì)胞凋亡的效果。因此p53-miR-34a/Sirt1反饋通路可能是治療IPF的一個(gè)潛在途徑。

3.2 MicroRNA和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、可逆的生物學(xué)過程，在EMT過程中上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性和黏附基底膜的特性，隨著細(xì)胞骨架的急劇變化而改變其形狀，并獲得了遷移、侵襲和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)的能力。EMT在許多肺部疾病中發(fā)揮作用，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌和IPF等。在IPF患者的肺上皮細(xì)胞中高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)表達(dá)增加，HMGA2作為let-7d的一個(gè)已知靶點(diǎn)被證明在EMT中發(fā)揮著重要作用，并可以促進(jìn)IPF的發(fā)展。let-7d屬于let-7家族，是最早發(fā)現(xiàn)的microRNA家族之一，其主要定位于肺泡上皮細(xì)胞中。在IPF的發(fā)展的過程中，肺泡上皮細(xì)胞中l(wèi)et-7d表達(dá)明顯降低。let-7d表達(dá)的抑制被認(rèn)為會(huì)促進(jìn)EMT過程，并增加肺內(nèi)膠原沉積。Huleihel等[9]向肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染let-7d并用TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過檢測發(fā)現(xiàn)HMGA2和包括α-SMA在內(nèi)的間充質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)明顯降低。在實(shí)驗(yàn)性肺纖化小鼠模型中，miRNA-26a表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，并且miRNA-26的缺失在體內(nèi)和體外均可以促進(jìn)EMT的發(fā)展。Liang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-26a可以和HMGA2的3′-UTR端結(jié)合，并證實(shí)了miR-26a可以通過轉(zhuǎn)錄的方式直接調(diào)節(jié)HMGA2表達(dá)。通過向肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-26a，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-26a可以抑制EMT和纖維化的形成。因此miRNA-26在肺纖維化EMT發(fā)生的過程中可能發(fā)揮重要作用，其可能是IPF的潛在治療靶點(diǎn)。

3.3 MicroRNA和肺部炎癥目前，由于抗炎藥物在IPF的治療中效果并不明顯，炎癥在肺纖維化的發(fā)展過程中的作用仍存在爭議，但是仍有很多證據(jù)表明炎癥在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，炎癥幾乎伴隨著整個(gè)肺纖維化的發(fā)展過程。炎性小體是機(jī)體固有免疫的重要組分，在機(jī)體的免疫反應(yīng)和疾病的發(fā)生中具有重要作用，在炎性疾病的發(fā)展過程中，炎性小體既起著致病作用，又能促進(jìn)疾病的發(fā)展[11]。炭黑納米顆粒(carbon black nanoparticle,CBNP)是一種超細(xì)碳顆粒,它是空氣污染如細(xì)顆粒物(PM2.5)、汽車尾氣等的主要成分。最近的研究顯示，當(dāng)大鼠長期暴露于CBNPs環(huán)境下肺部會(huì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的浸潤和明顯的纖維化改變。FOXOa3是miR-96的一個(gè)作用靶點(diǎn),相關(guān)研究表明叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a(forkhead transcription factor 3a,FOXO3a)和NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體的激活呈正相關(guān)。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)在CBNPs處理的支氣管上皮細(xì)胞中miR-96表達(dá)降低，并伴隨著FOXO3a、NLRP3炎性小體和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表的達(dá)明顯上升，有趣的是,當(dāng)向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-96后，上述蛋白表達(dá)受到了抑制，這一結(jié)果表明了miR-96的缺失可以導(dǎo)致FOXOa3表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)NLRP3炎性小體的激活并加重IPF程度。用脂多糖處理的小鼠肺組織進(jìn)行HE染色后，發(fā)現(xiàn)有明顯炎癥改變和明顯的間充質(zhì)蛋白水平升高，同時(shí)伴隨著miR-506的表達(dá)水平的明顯降低。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)無論在體內(nèi)還是體外，miRNA-506均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也可以改善炎癥反應(yīng)，除此之外miR-506還可以靶向作用于NF-κB亞基p65的3′-UTR端而降低其表達(dá)，而當(dāng)p65表達(dá)受抑制時(shí)，肺組織纖維化改變和炎癥明顯減輕。因此miR-506可能不僅僅是細(xì)胞凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)因子，也是肺纖維化的重要調(diào)節(jié)因子。

3.4 MicroRNA和細(xì)胞自噬自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的降解系統(tǒng)，自噬通過對(duì)細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)和大分子物質(zhì)的降解以及對(duì)分解產(chǎn)物的回收利用，在維持細(xì)胞存活和更新中起著重要作用。自噬的過程需要形成一個(gè)雙膜結(jié)構(gòu)的自噬體，自噬體會(huì)包含著被隔離的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進(jìn)行內(nèi)容物降解。自噬可以參與纖維化的過程，同時(shí)在纖維化疾病中細(xì)胞外基質(zhì)的降解中也發(fā)揮重要作用。人微管關(guān)聯(lián)蛋白1輕鏈3(human microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)通常用于檢測培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物組織中的自噬，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是評(píng)價(jià)自噬活性的常用指標(biāo)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值在IPF患者和博來霉素處理的小鼠的肺中明顯降低，同時(shí)p62的表達(dá)明顯上升，p62的表達(dá)水平與自噬的活性呈負(fù)相關(guān)，這說明了在IPF患者和博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠體內(nèi)自噬水平下降。在纖維化的肺組織和TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中，自噬的活性受到了明顯的抑制。miR-449a的表達(dá)水平在IPF的過程中是下調(diào)的，Han等人[14]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-449a可以減輕二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化，此外無論在體內(nèi)和體外，miR-449a可以誘導(dǎo)自噬活性增強(qiáng)，在此過程中Bcl-2被認(rèn)為是miR-449a的作用靶點(diǎn)。Beclin1基因是第一個(gè)被證明的自噬所必需的人類蛋白質(zhì)，而Bcl-2被證明可以通過與Beclin1相互作用抑制酵母和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的Beclin1依賴性自噬[15]。因此miR-449a通過靶向抑制Bcl-2表達(dá)可以促進(jìn)自噬活性增強(qiáng)，從而減輕肺纖維化的程度。

3.5 MicroRNA和肌成纖維細(xì)胞分化在正常組織的修復(fù)過程中，當(dāng)組織愈合過程結(jié)束以后，肌成纖維細(xì)胞收縮活動(dòng)結(jié)束，肌成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。但在IPF的情況下，由于TGF-β因子的過度激活，致使成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞增多，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)在肺組織中存在，與肺成纖維細(xì)胞相比，肌成纖維細(xì)胞可以分泌更多細(xì)胞外基質(zhì)和膠原成分，導(dǎo)致肺間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)成分增多，進(jìn)一步加重肺纖維化[16]。已有證據(jù)表明miRNAs在肌成纖維細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮作用。Yang等[17]發(fā)現(xiàn)無論IPF患者還是TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞中，miR-145表達(dá)都是下降的，向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145后發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)增多，同時(shí)也促進(jìn)了肌成纖維細(xì)胞灶的形成和纖維粘連。并且抑制miR-145在動(dòng)物模型中的表達(dá)時(shí)，減輕了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。這些證據(jù)說明了miR-145可以調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的分化而參與IPF的發(fā)生和發(fā)展過程。有研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中miR-27-3p表達(dá)降低。Cui等[18]發(fā)現(xiàn)miR-27-3p可以靶向作用于smad2，smad4和α-SMA蛋白抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，此外miR-27-3p也可以抑制成纖維細(xì)胞的收縮，從而避免瘢痕的形成。這說明了miR-27-3p可以通過抑制肺肌成纖維細(xì)胞的分化影響肺纖維化發(fā)展，其可能是治療肺纖維化的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

3.6 MicroRNA和膠原蛋白生成在正常的肺組織中，膠原蛋白的生成是上皮細(xì)胞損傷觸發(fā)的組織愈合過程的一部分。而在IPF發(fā)展的過程中，大量生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶參與疾病的進(jìn)程，過量的基質(zhì)金屬蛋白酶可以破壞基底膜，從而使肺成纖維細(xì)胞進(jìn)入肺泡間隙，在其中增殖并產(chǎn)生膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)，最終造成細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，進(jìn)一步促進(jìn)IPF的發(fā)展過程。在發(fā)生纖維化的肺組織中，由于成纖維細(xì)胞異常增生并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，大量的Ⅰ型膠原蛋白在肺泡壁內(nèi)沉積，影響肺泡細(xì)胞的通氣功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸問題。在IPF的肺組織中，miR-29c的表達(dá)明顯降低，miR-29c被認(rèn)為與Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Khalil等人[19]發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中miR-29的表達(dá)下調(diào)與組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 4,HDAC4)的表達(dá)降低有關(guān)。在IPF患者的成纖維細(xì)胞中過表達(dá)HDAC4可以恢復(fù)miR-29c的表達(dá)水平，同時(shí)抑制了I型膠原蛋白的表達(dá)。Ⅴ型膠原蛋白是一種小膠原蛋白，通常被隔離在肺間質(zhì)內(nèi)。在IPF的肺組織中，由于發(fā)生組織重塑，導(dǎo)致了Ⅴ型膠原蛋白的暴露和過表達(dá)。熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-185和miR-186可以直接調(diào)控Ⅴ型膠原蛋白的表達(dá)。miR-185和miR-186的表達(dá)水平與IPF的嚴(yán)重程度無關(guān)，但Lei等人[20]發(fā)現(xiàn)miR-185和miR-186的過表達(dá)可以阻斷TGF-β誘導(dǎo)的Ⅴ型膠原蛋白生成。這說明了miR-185和miR-186可以通過阻斷Ⅴ型膠原蛋白產(chǎn)生參與肺纖維化發(fā)展過程。

4 展望

綜前所述，miRNA在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，這些發(fā)現(xiàn)表明了miRNA既可以作為肺纖維化診斷的指標(biāo)，也可以是肺纖維化疾病的治療靶點(diǎn)。目前miRNA已被證實(shí)了可以通過多種途徑抑制肺纖維化的發(fā)展，通過調(diào)控miRNA的表達(dá)治療肺纖維化可能是一個(gè)新的策略。雖然需要進(jìn)一步的研究去解決miRNA應(yīng)用于臨床治療技術(shù)上的障礙，但納米技術(shù)的發(fā)展和miRNA化學(xué)類似物的研究有望加速miRNA在肺纖維化治療上的應(yīng)用。