陳志英，李文陽，崔廣榮

（安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

甜葉菊（Stevia rebaudian）是菊科，屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭的原始森林，1977年我國引進(jìn)栽培才獲得成功，喜溫暖潮濕的環(huán)境，對光照敏感，它的葉片中含有甜葉菊糖苷，是一種高甜度、低熱量的天然甜味劑，甙甜度是蔗糖的250 ～300 倍，但所含熱量僅是蔗糖的1/300，是食品及藥品工業(yè)的原料之一［1?5］。近幾年來，隨著甜葉菊在藥品、食品以及在工業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛，市場對甜葉菊的需求量也在逐步增加，栽培面積也在不斷擴(kuò)大，需要更多的優(yōu)質(zhì)種苗，育苗是甜葉菊生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。甜葉菊繁殖方式可分為種子繁殖和組培快繁或扦插育種，組培快繁能夠獲得大量高質(zhì)幼苗。國內(nèi)外有眾多專家通過莖尖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)等離體培養(yǎng)途徑實(shí)現(xiàn)甜葉菊快速繁殖［5?9］，研究發(fā)現(xiàn)外源激素對多種作物增殖和生根產(chǎn)生重要影響［10?14］。本研究以‘惠農(nóng)5 號’為材料，探討了不同外源激素的濃度配比及組合對甜葉菊試管苗增殖的影響，為工廠化育苗、提高繁殖效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 由蚌埠永生農(nóng)業(yè)科技有限公司提供的新品種‘惠農(nóng)5 號’。

1.1.2 主要儀器 組織培養(yǎng)專用容器、電子分析天平、高壓滅菌鍋、無菌操作臺(tái)、刀剪鑷滅菌器、無菌紙、稱量紙、玻璃棒。

1.1.3 主要試劑 6?BA（6?芐氨基嘌呤）、KT（激動(dòng)素）、Ad（腺嘌呤硫酸鹽）、NAA（萘乙酸）、KOH（氫氧化鉀）、70%酒精、蒸餾水、無菌水、pH 試紙。

1.1.4 基本培養(yǎng)基配方 繼代培養(yǎng)基配方：MS+6?BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+瓊脂粉5.5 g/L；增殖培養(yǎng)基配方：MS + NAA 0.1 mg/L + 糖30 g/L；生根培養(yǎng)基配方：1/2 MS +糖20 g/L+瓊脂粉5.5 g/L，糖為白砂糖，pH 控制在5.8。

1.2 方法

1.2.1 不同外源激素組合的濃度 在增殖培養(yǎng)基中分別添加：①6?BA，其濃度分別為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。② KT，其濃度分別為 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。③ Ad，其濃度分別為 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。

1.2.2 試管苗接種與培養(yǎng) 鑷子剪刀高溫滅菌，取試管苗在無菌盤上剪成1 cm 長的莖段，插入已配好的培養(yǎng)基中輕按固定，切勿倒插，每瓶接4 個(gè)莖段，每個(gè)組合要接種10 瓶，貼好標(biāo)簽，寫上日期和激素濃度，置于組織培養(yǎng)室每天12 h 光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 600 ～ 2 000 Lux，在（25 ± 1）℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)期記錄接種時(shí)間、外植體莖段的生長發(fā)育成為無菌苗的情況，及時(shí)處理污染的培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基間進(jìn)行污染。在試管苗增殖試驗(yàn)一個(gè)月后要測量株高，記錄無菌苗增殖數(shù)，觀察無菌苗生長狀況，計(jì)算平均增殖率（增殖苗形成數(shù)與接種莖段數(shù)之比），生根實(shí)驗(yàn)25 d后，記錄甜葉菊試管苗每株平均根數(shù)、平均根長，計(jì)算生根率（所有生根株數(shù)占總株數(shù)之比），觀察其根系發(fā)生和生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素6-BA 和NAA 的組合對甜葉菊試管苗增殖的影響

結(jié)果見表1。表1 數(shù)據(jù)結(jié)果表明外源激素6?BA 和NAA 對甜葉菊試管苗增殖都起著重要作用。從平均株高上來看，各處理與對照間差異均達(dá)到了顯著水平；從增殖系數(shù)來看，2.0 mg/L 6?BA 與 0.1 mg/L NAA 處理的增殖系數(shù)最高，4.0 mg/L 6?BA 與 0.1 mg/L NAA 處理的增殖系數(shù)最低；從增殖系數(shù)顯著差異分析來看，除了處理A?5 與處理A?1、處理A?6 有顯著性差異外，其余處理間沒有顯著性差異，其中2.0 mg/L 6?BA 與0.1 mg/L NAA 處理增殖系數(shù)明顯高于A?1（CK）處理。以上結(jié)果表明2.0 mg/L 6?BA 與0.1 mg/L NAA 處理對甜葉菊試管苗增殖影響最大（見圖1），該培養(yǎng)基下甜葉菊試管苗增殖系數(shù)最高，是形成健壯試管苗最合適的培養(yǎng)基。

表1 外源激素6-BA 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響及顯著性差異Tab.1 Effects of the combination of exogenous hormones 6-BA and NAA on the proliferation of stevia in vitro seedlings and its significant difference

圖1 6-BA 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響Fig.1 Effects of the combination of exogenous hormones 6-BA and NAA on the proliferation of stevia in vitro seedlings

2.2 外源激素KT 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響

結(jié)果見表2。表2 的結(jié)果清晰地反映了細(xì)胞分列素KT 和生長素NAA 及其組合對甜葉菊試管苗增殖有影響。單獨(dú)使用生長素NAA 或不使用任何生長調(diào)節(jié)劑的情況下，顯然是不利于試管苗的增殖的。從平均株高上來看，各處理與對照間差異是明顯的，達(dá)到了顯著水平；從增殖系數(shù)角度看，2.0 mg/L KT 與0.1 mg/L NAA 處理的增殖系數(shù)最高，可達(dá)3.19；除了處理X?5 與處理X?1（CK）有顯著差異外，其余處理間沒有顯著差異。本試驗(yàn)中2.0 mg/L KT 與0.1 mg/L NAA組合使用，有利于試管苗的增殖（見圖2）。

表2 外源激素KT 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響及顯著性差異Tab.2 Effects of the combination of exogenous hormones KT and NAA on the proliferation of stevia in vitro seedlings and its significant difference

圖2 KT 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響Fig.2 Effects of the combination of exogenous hormones KT and NAA on the proliferation of stevia in vitro seedlings

2.3 外源激素Ad 和NAA 的組合對甜葉菊試管苗增殖的影響

結(jié)果見表3。表3 結(jié)果表明，Ad 能在一定程度上促進(jìn)甜葉菊試管苗的增殖，而且試管苗的增殖系數(shù)隨著濃度的增加而逐漸增大，到達(dá)一定限度后增殖系數(shù)逐漸降低（如I?5 處理）。從平均株高上來看，各處理與對照間差異均達(dá)到了顯著水平；從增殖系數(shù)來分析，增殖系數(shù)最高的為1.0 mg/L Ad 與 0.1 mg/L NAA 處理組合（圖 3），增殖系數(shù)最低的為 0 mg/L Ad 與 0.1 mg/L NAA 處理組合；從增殖系數(shù)顯著差異角度來看除了I?1（CK）與I?4 組合有明顯差異外，其余組合間無顯著性差異，其中1.0 mg/L Ad 與0.1 mg/L NAA 處理增殖系數(shù)明顯高于I?1（CK）處理，高1.15，以上結(jié)果表明1.0 mg/L Ad與0.1 mg/L NAA 處理對甜葉菊試管苗生長及增殖的影響最大。

表3 外源激素Ad 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響及顯著性差異Tab.3 Effects of the combination of exogenous hormones Ad and NAA on the proliferation of stevia in vitro seedlings and its significant difference

圖3 Ad 和NAA 組合對甜葉菊試管苗增殖的影響Fig.3 Effects of the combination of exogenous hormones Ad and NAA on the proliferation of stevia in vitro seedlings

2.4 外源激素6-BA 和NAA 其組合對甜葉菊試管苗生根的影響

不同外源激素6?BA 和NAA 組合對甜葉菊試管苗生根的影響結(jié)果見表4。與對照（不加6?BA）相比，添加外源激素6?BA 會(huì)顯著降低根長，且隨著6?BA 濃度的增加，根長降低幅度增加，特別是A?6 處理。與對照處理相比，增加低濃度的6?BA 濃度，試管苗平均根長變化不顯著，而6?BA 濃度過量會(huì)顯著降低平均根長。

表4 外源激素6-BA 和NAA 組合對甜葉菊試管苗生根的影響及顯著性差異Tab.4 Effects of the combination of exogenous hormones 6-BA and NAA on the rooting of stevia in vitro seedlings and its significant difference

2.5 外源激素KT 和NAA 其組合對甜葉菊試管苗生根的影響

結(jié)果見表5。由表5 可以看出，對于甜葉菊的生根培養(yǎng)，KT 和NAA 其組合激素均能誘導(dǎo)試管苗的生根，其中誘導(dǎo)甜葉菊生根的X?2、X?3、X?5 誘導(dǎo)生根率達(dá)到100%，隨著KT 濃度的升高，甜葉菊的生根率也明顯降低，根系較纖弱。與對照（不加KT）相比添加外源激素KT 會(huì)顯著降低根長，特別是X?4 處理。

表5 外源激素KT 和NAA 組合對甜葉菊試管苗生根的影響及顯著性差異Tab.5 Effects of the combination of exogenous hormones KT and NAA on the rooting of stevia in vitro seedlings and its significant difference

2.6 外源激素Ad 和NAA 其組合對甜葉菊試管苗生根的影響

結(jié)果見表6。從表6 可知，I?2 至I?6 為外源激素Ad 處理組合，從平均根長來看，最大的為CK，最小的為處理I?6。CK 與處理I?6 有顯著性差異，與其他處理組合間無明顯差異。與對照相比，隨著Ad 濃度的增加，根系較纖弱，不添加Ad 激素，其根系越健壯。

表6 外源激素Ad 和NAA 組合對甜葉菊試管苗生根的影響及顯著性差異Tab.6 Effects of the combination of exogenous hormones Ad and NAA on the rooting of stevia in vitro seedlings and its significant difference

3 討論與小結(jié)

3.1 討論

外源激素是指非機(jī)體本身產(chǎn)生的，而從外界攝入體內(nèi)的激素，也可以是人工合成的，也有可能是從其他植物體內(nèi)提取的，能對植物體的生長發(fā)育有很大影響的一類激素，其中6?BA 能促進(jìn)莖葉的伸長生長，芽的生長；KT 能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和器官分化，抑制頂端優(yōu)勢，延緩組織衰老；Ad 能夠促進(jìn)分化、生根。

植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑的使用濃度、種類及其組合方式的都是一個(gè)關(guān)鍵性問題。在不同培養(yǎng)階段不同植物所需的植物生長調(diào)節(jié)劑可能不一樣，同一植物不同品種間的培養(yǎng)方法不同。所以培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度配比及其組合值得深入研究。談靜等［11］研究表明6?BA 4.0 mg/L與0.2 mg/L NAA 組合能提高蝴蝶蘭增殖系數(shù)，6?BA 5.0 mg/L與0.2 mg/L NAA的組合平均根長是最長的，其生根效果也是極顯著的；朱宏等［12］研究證明不同的外源激素處理對增殖及生根的確有影響，其中6?BA 1.5 mg/L 與IBA 0.1 mg/L 的組合相對于其他外源激素對桑樹無菌苗的增殖具有良好的促進(jìn)作用。在增殖試驗(yàn)中，6?BA、KT 和Ad 作為細(xì)胞分裂素，能提高其達(dá)到一定增殖系數(shù)的速率。本研究結(jié)果表明，甜葉菊新品種‘惠農(nóng)5 號’的6?BA 最適濃度為2.0 mg/L，大于最適值時(shí)有抑制效果；KT 最適濃度為2.0 mg/L，大于最適值時(shí)增殖系數(shù)反而降低；Ad最適濃度為1.0 mg/L。本試驗(yàn)篩選出適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ NAA 0.1 mg/L +糖 20 g/L + 瓊脂粉 5.5 g/L，但是蘇彩霞等［13］研究表明 1/2 MS + NAA 0.2 mg/L + 糖 20 g/L +瓊脂粉5.5 g/L 為最佳培養(yǎng)基，而孫濤等［14］的研究表明最佳生根培養(yǎng)基為MS + 1.25 mg/L IBA +0.05 mg/L NAA + 30.0 g/L 蔗糖 + 7.0 g/L 瓊脂。這與本試驗(yàn)結(jié)果不同，可能與甜葉菊的品種、基因型不同或激素有關(guān)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，與其他植物相比較，本品種的甜葉菊試管苗增殖率的提高有很大進(jìn)步空間，其中一個(gè)重要原因是試管苗在試管苗增殖過程中形成叢芽較困難，易形成簇狀苗，具體原因有待進(jìn)一步研究探索。

3.2 小結(jié)

甜葉菊試管苗的增殖和生根受激素濃度組合的影響，其作用也是顯著的。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，6?BA 濃度為 2.0 mg/L 和 NAA 濃度為 0.1 mg/L 時(shí)，KT 濃度為 2.0 mg/L 和 NAA 濃度為 0.1 mg/L時(shí)，Ad 濃度為2.0 mg/L 和NAA 濃度為0.1 mg/L 時(shí)，都能使甜葉菊試管苗進(jìn)行增殖，其中6?BA 2.0 mg/L 與NAA 0.1 mg/L 組合使用增殖系數(shù)最高且植株生長情況最佳。對于生根來說，添加外源激素對試管苗生根幾乎是沒有影響的，但是除了Ad 外，其他外源激素對甜葉菊試管苗的根生長有一定的促進(jìn)作用，根長度都有不同程度的增長。最適合甜葉菊試管苗增殖的培養(yǎng)基為：MS + NAA 0.1 mg/L + 6?BA 2.0 mg/L + 瓊脂粉5.5 g/L + 糖30 g/L；最適合試管苗生根的培養(yǎng)基為1/2 MS + NAA 0.1 mg/L + 瓊脂粉5.5 g/L + 糖20 g/L。