脂聯(lián)素基因修飾對大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞活性的影響及機制探討

陳麗芳，戴穎儀，林宋斌，盧?？?，劉新通

(1.福建省莆田市涵江區(qū)平民醫(yī)院超聲科，福建 莆田 351115；2.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510280；3.廣東省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510317)

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血管內(nèi)皮的前體細胞，來源于骨髓或者外周血細胞，參與新生血管的形成[1]和損傷血管修復(fù)[2]。EPC作為重要的內(nèi)源性血管修復(fù)因素，在機體循環(huán)中其正常數(shù)量和功能的維持被認(rèn)為與血管損傷性疾病密切相關(guān)[3，4]。循環(huán)內(nèi)EPC在組織缺血損傷后可內(nèi)源性動員，歸巢于缺血部位，并且分化為成熟的內(nèi)皮細胞參與血管新生[5]，這為缺血性疾病治療提供了新思路。許多研究表明EPC移植對缺血性腦卒中有積極的治療作用[6，7]。然而在病理條件下，EPC的遷移、歸巢和分化能力受損[8，9]?；蛐揎検且环N有潛力的提高EPCs遷移、增殖和分化能力的方法。許多研究表明移植基因修飾的EPC能夠有效修復(fù)血管損傷[10，11]和缺血造成的損傷[12-14]。

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是大量存在于血液中的主要由脂肪細胞分泌的細胞因子，除了具有改善機體血脂、血糖代謝的作用外，還具有抑制動脈粥樣硬化、促進缺血組織局部血管新生等作用[15，16 ]。研究表明，APN促進EPC的增殖、遷移、分化和形成管腔樣結(jié)構(gòu)[17，18]，而且與EPC治療的大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠相比，APN基因修飾EPC治療組的行為功能、梗死面積百分比、微血管密度和細胞凋亡率的改善更明顯[13]。雖然有研究表明球形脂聯(lián)素通過恢復(fù)內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性改善高糖抑制的內(nèi)皮祖細胞活性[19]，但是在正常及其它病理條件下，APN改善EPC活性的機制尚不明確。在培養(yǎng)的大鼠心肌細胞中，脂聯(lián)素治療刺激血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成[20]，而VEGF通過誘導(dǎo)連接蛋白43(connexin 43，Cx43)表達促進EPC分化[21]。因此推測APN通過促進VEGF表達和eNOS活化增強EPC的功能。eNOS的活性受多個位點磷酸化調(diào)控，研究最為透徹的兩個位點是激活位點絲氨酸殘基1177(Ser1177)和抑制位點蘇氨酸殘基495(Thr495)[22]。基于上述分析，本研究旨在探索APN基因修飾對EPC的活性以及EPC中VEGF表達水平、eNOS活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3-4周齡健康雄性SD大鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體重約90 g。293T細胞購自廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司(C14126)。pLKIRG載體(廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司，P16012)，F(xiàn)icoll-Paque PLUS(GE Healthcare，17-5442-02)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，SH30022-01B)，F(xiàn)BS(Hyclone，1027-106)，胰蛋白酶(Sigma，T1426-250MG)，TRIzol試劑(Invitrogen，15596026)，qPCR Lentivirus Titration Kit(abm，Lv900)，SYBR GREEN(TOYOBO，QPK-201)，RIPA裂解液(碧云天，P0013B)，Adiponectin小鼠單克隆抗體抗體(abcam，ab22554)，VEGF小鼠源單克隆抗體(ABclonal，A17877)，磷酸化VEGFR 2(Tyr1175)兔源多克隆抗體(AP0382，ABclonal)，eNOS兔源多克隆抗體(A1548，ABclonal)，磷酸化eNOS (Thr1177)兔源多克隆抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-3447R)，GAPDH兔多克隆抗體(proteintech，10494-1-AP)，CCK8試劑(碧云天，C0039)、結(jié)晶紫(BIOSHARP，Amresco 0528)。

1.2 大鼠EPCs的分離與培養(yǎng)

異氟烷麻醉處死SD大鼠后，迅速在無菌條件下分離股骨和脛骨，剪除骨干兩端骨骺，顯露髓腔，用1 mL培養(yǎng)基(無血清)沖出骨髓于離心管中，吹打制成細胞懸液。600×g離心5 min，棄去上清液，采用Ficoll-Paque PLUS溶液密度梯度離心法分離單個核細胞，PBS 洗滌后用1 mL EGM-2 BulletKit培養(yǎng)基重懸單個核細胞，接種到10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、90%濕度的培養(yǎng)箱中定向誘導(dǎo)培養(yǎng)。72 h后，用培養(yǎng)基清洗未粘連的細胞，貼壁細胞用新鮮EGM-2 BulletKit培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)，每隔2天半量換培養(yǎng)基。用顯微鏡觀察EPC形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，細胞達到80%-90%融合時，用胰蛋白酶消化后按照1：3比例傳代。

1.3 APN慢病毒真核表達載體克隆構(gòu)建

使用 TRIzol 法提取大鼠EPC的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。以cDNA為模板，用APN-F和APN-R引物進行PCR，擴增APN的編碼序列，引物的序列見表1。PCR擴增產(chǎn)物和pLKIRG載體用NheⅠ、 XmaⅠ切割，切膠回收后，將APN的編碼序列連接到慢病毒真核表達空載體pLKIRG中。APN慢病毒真核表達載體用NheⅠ、XmaⅠ雙酶切檢測，并且送華大基因公司進行測序驗證。

1.4 慢病毒包裝及病毒滴度檢測

提前1 d把293T細胞接種到10 cm培養(yǎng)皿，細胞融合度達到80%左右時，將pLKIRG載體、APN慢病毒真核表達載體分別與慢病毒包裝載體PPACK-H1-GAG、PPACK-HI -REV、PVSV-G按照3：1：1：1的比例轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后24、48 h時分別收集細胞培養(yǎng)液， 4℃，82 700×g超速離心2 h濃縮培養(yǎng)液中的慢病毒顆粒，按照qPCR Lentivirus Titration Kit的操作手冊檢測病毒滴度。

1.5 慢病毒感染細胞及篩選穩(wěn)定細胞株

EPC細胞提前一天接種到6孔板中，細胞融合度達到60%左右時，用APN基因重組慢病毒及對照慢病毒分別感染EPC細胞，感染10 h后換為正常培養(yǎng)基，慢病毒感染48 h后用0.1 μg/μl嘌呤霉素篩選3 d，然后收集細胞。

1.6 Real-time PCR 檢測

使用 TRIzol 法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。用SYBR GREEN進行Real-time PCR檢測，選擇GAPDH基因作為內(nèi)參，使用的引物的序列見表1。根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果的CT值計算試驗結(jié)果，目的基因的相對表達水平=2-△△Ct。

表1 引物的序列

1.7 Western blot檢測

PBS漂洗各組EPC，加入冰預(yù)冷的RIPA裂解液裂解細胞，12 000×g離心10 min，收集上清液，取5 μL上清液測定蛋白濃度。每組20 μL樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜上，室溫下用5% BSA封閉3 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜， TBST洗膜3次，室溫下用二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL顯色，用成像系統(tǒng)拍照。選擇GAPDH作為內(nèi)參。

1.8 CCK8檢測細胞增殖

消化生長狀態(tài)良好的各組細胞，制備25 000個/mL的細胞懸液，接種于96 孔板中，每孔接種200 μL，每組5個孔。將培養(yǎng)板放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)4、24、48 h和72 h。向每孔加入20 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測量450 nm波長的吸光度。

1.9 Transwell檢測細胞遷移

消化生長狀態(tài)良好的各組細胞，制備細胞懸液，接種5×104細胞于上室，下室補充500 μL完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用PBS清洗細胞，然后用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，將貼附于微孔膜下層的細胞用多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色后用刀片將微孔膜割下，放置在載玻片上，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，400倍視野下隨機選取5個視野拍照、計數(shù)，取平均數(shù)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠EPC的培養(yǎng)及鑒定

用EGM-2 BulletKit培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)大鼠股骨和脛骨骨髓來源的單個核細胞14 d，最初細胞為懸浮狀態(tài)，第3天可見少量梭形貼壁細胞，隨后逐漸出現(xiàn)細胞集落，第7天細胞呈梭形或者多邊形，第14天細胞融合度達到90%左右，呈鋪路石樣外觀(圖1)。

免疫熒光檢測內(nèi)皮細胞的表面標(biāo)志物CD34對EPC進行鑒定，EGM-2 BulletKit培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后細胞CD34表達陽性率大于90%(圖2)。上述結(jié)果表明，大鼠骨髓來源單個核細胞在用EGM-2 BulletKit培養(yǎng)基培養(yǎng)14d后，表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞特征。

2.2 APN慢病毒真核表達載體構(gòu)建

以由大鼠EPC的總RNA逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，PCR擴增得到APN基因的編碼序列(圖3a)。純化的PCR產(chǎn)物(758 bp)被連接到慢病毒真核表達空載體pLKIRG上。連接后的表達載體(9 635 bp)用NheⅠ、 XmaⅠ雙酶切檢測(切割成745 bp、8 890 bp的兩個片段)，結(jié)果完全符合預(yù)期(圖3b)，并且比對測序結(jié)果，在 NCBI 中找到了與 APN基因編碼序列完全一致的區(qū)域。

CBAD

CBA

2.3 APN過量表達細胞株構(gòu)建

用APN慢病毒真核表達載體、空載體分別包裝的慢病毒感染EPC，嘌呤霉素藥篩3 d后收集細胞檢測APN mRNA和蛋白的表達水平。檢測結(jié)果顯示EPC-APN中APN mRNA的表達水平顯著升高，與對照組相比升高了約11倍(圖4a)，APN蛋白的表達水平明顯增高(圖4b)。

2.4 APN基因修飾對EPC增殖的影響

CCK8結(jié)果顯示，在4 h時EPC-APN與EPC-NC的吸光度沒有顯著差異，在24、48 h和72 h時EPC-APN的吸光度顯著增加，分別比EPC-NC的增加23.8%、10.9%和8.8%(圖5)，這表明在24、48 h和72 h時EPC-APN的增殖能力比EPC-NC的顯著增加。

CBAD

1614121086420APNmRN的相對表達水平**EPC-NCEPC-NCEPC-APNEPC-APNAPNGAPDHAB

EPC-NC1.81.51.20.90.60.30OD(450nm)******2448724h

2.5 APN基因修飾對EPC遷移的影響

Transwell結(jié)果顯示，與EPC-NC相比，EPC-APN的遷移能力顯著增強，遷移到微孔膜下側(cè)的EPC-APN的數(shù)量接近EPC-NC的2倍(圖6)。

EPC-NCEPC-APN***EPC-APNEPC-NC6050403020100平均遷移細胞數(shù)(個)AB

2.6 APN基因修飾對EPC中VEGF、磷酸化VEGFR2、eNOS和磷酸化eNOS水平的影響

qPCR的結(jié)果表明，EPC-APN中VEGF、eNOS mRNA的表達水平較EPC-NC中的顯著升高(圖7a)。WB的結(jié)果表明，與EPC-NC相比，EPC-APN的VEGF、磷酸化血管內(nèi)皮生長因子受體2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2)、eNOS和Ser1177位點磷酸化eNOS的豐度明顯增加(圖7b)。

765432103210VEGFmRNA的相對表達水平eNOSmRNA的相對表達水平EPC-APNEPC-NCEPC-APNEPC-NC****EPC-APNEPC-NCVEGFp-VEGFR2eNOSp-eNOSGAPDHABC

3 討論

本研究將大鼠骨髓來源的單個核細胞誘導(dǎo)成EPC，構(gòu)建了APN基因慢病毒真核表達載體，通過慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建了APN基因修飾的EPC，并且研究了APN基因修飾對EPC增殖和遷移能力的影響及其機制。本研究的結(jié)果表明大鼠APN基因修飾增強大鼠骨髓來源的EPC的增殖和遷移能力(圖5，6)，這與在培養(yǎng)基中添加人源APN對人源EPC的影響一致[17，18]。APN基因修飾EPC的增殖和遷移能力更強，故對腦缺血的治療效果比EPC更好[13]。圖7表明APN基因修飾促進EPC中VEGF、eNOS表達，以及VEGFR2、eNOS Ser1177位點磷酸化。VEGFR2是內(nèi)皮細胞中VEGF誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，結(jié)合配體時自磷酸化并被激活[23]，磷酸化的VEGFR2募集互作蛋白，誘導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。APN基因修飾能夠誘導(dǎo)EPC表達VEGF，故可以促進VEGFR2磷酸化。eNOS Ser1177位點磷酸化可以激活eNOS[22]，因此APN基因修飾促進EPC中的eNOS活化。eNOS的表達水平和活性對EPC的遷移和血管生成至關(guān)重要[25，26]。由eNOS催化生成的NO通過亞硝基化和誘導(dǎo)VEGF表達促進EPC從骨髓中動員[25]。VEGF反饋促進eNOS在Ser1177處磷酸化，通過活化的eNOS動員骨髓來源的EPC[26，27]，并且通過誘導(dǎo)Cx43表達促進EPC分化[21]。有研究表明APN通過AMPK信號通路誘導(dǎo)VEGF表達和eNOS Ser1177磷酸化[20，28]，至于VEGF與eNOS哪一個在通路的上游，或者APN可以通過不同的信號通路誘導(dǎo)VEGF表達和eNOS Ser1177位點磷酸化尚需要進一步研究。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明APN基因修飾很可能通過促進EPC中VEGF、eNOS表達及eNOS活化增強EPC的活性。本研究為利用APN修飾的EPC治療血管損傷性疾病和缺血性疾病提供了理論依據(jù)。