牛流行熱病毒熒光定量PCR檢測方法的建立

阮謙 劉應(yīng)華 趙謙 王蕾 尹革芬

摘 要：鑒于牛流行熱（Bovine Ephemeral Fever，BEF）對養(yǎng)牛行業(yè)的危害以及熒光定量PCR技術(shù)高效、快速、精準的優(yōu)點，本研究針對牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）G基因建立熒光定量PCR檢測方法。并用所建立的熒光定量PCR檢測方法對臨床采集的樣本進行檢測。結(jié)果顯示：在GenBank數(shù)據(jù)庫中對BEFV全基因組序列進行比對分析，找出保守序列，設(shè)計1對擴增BEFV G基因片段的引物，通過分子克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒制備標準曲線，擴增效率是95.1%，用所建立的方法檢測臨床樣本，陽性15份，陽性率為75%。該試驗成功建立了檢測BEFV的熒光定量PCR檢測方法，證明云南省的牛場中廣泛存在BEFV，建立的熒光定量PCR檢測方法對BEFV的臨床診斷和流行病學調(diào)查等具有應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：牛流行熱病毒;熒光定量PCR;檢測方法

牛流行熱（Bovine Ephemeral Fever，BEF）是由牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）引起牛機體內(nèi)部溫度突然升高、呼吸困難、腸胃功能異常、全身無力、不靈活和行動異常的一種傳染疾病。該病傳播速度極快，很多地方的牛群都難避免，并且流行具有一定的周期性。BEF可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，妊娠奶牛出現(xiàn)流產(chǎn)，會給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-3]。該病大多發(fā)生在夏、秋蚊子活躍期，雨季或晝夜溫差大容易引起流行[4]。健康牛被蚊蟲叮咬后，如果該蚊蟲叮咬過病牛，即會感染。目前，BEFV被歸入彈狀病毒科，病毒外型為子彈型，核酸為單股負鏈RNA，有5種結(jié)構(gòu)蛋白，對脂類物質(zhì)敏感[5-6]。

據(jù)近年來的相關(guān)報道，BEF對牛群的危害日趨嚴重，所以需要建立一種實用、敏感且快速便捷的分子檢測方法，以便做到早確診、早隔離、早治療，最大限度地降低BEF帶來的損失[7]。為了滿足現(xiàn)今牛場對BEF的檢測要求，本研究針對BEFV的G基因設(shè)計一對特異性引物，建立熒光定量PCR檢測方法，為臨床上BEF的診斷提供支持。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

樣本均采自云南省大理州兩個規(guī)?；觯瑸橐伤艬EFV感染的20份新鮮血液樣本，陽性對照為BEF疫苗。

1.1.2 主要儀器

移液器（KA0052521，DRAGON公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高速冷凍離心機（75005440，Thermo Fisher Scientific公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600，天能科技有限公司）、電泳儀（DYY-7C，北京六一儀器廠）、熒光定量PCR儀（580BR 12007，BIO-RAD公司）、恒溫水浴鍋（HWS12，上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.3 主要試劑

RNAiso Plus購自寶生物工程（大連）有限公司（Cat. No.9109）;DEPC購自Sigma公司（Cat. No.V900882）;氯仿、異丙醇、無水乙醇等由筆者的實驗室提供，均為分析純;熒光定量PCR相關(guān)試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑iScriptTM cDNA Synthesis Kit購自BIO-RAD公司（Cat. No.170-8891）;熒光染料SsoFastTM EvaGreen? Supermix購自BIO-RAD公司（Cat. No.172-5201AP）。

1.1.4 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI GenBank中公布的BEFV基因序列（MN781183.1、KY012742.1），設(shè)計一對擴增G基因片段的特異性引物（表1）用于PCR檢測。設(shè)計好的引物送昆明碩擎生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 BEFV RNA的提取

在2 mL離心管中加入300 μL處理好的疫苗及樣本，加入1 mL RNAiso Plus（TRIZOL），用力震蕩，使RNAiso Plus（TRIZOL）與樣本均勻混合，4 ℃靜置 10 min;10 min后加入200 μL的氯仿，用力震蕩，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min;小心吸取上層無色溶液約 ?500 μL于無RNAase的1.5 mL新離心管中，加入等量異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，使RNA沉淀于離心管底部;小心倒去上清，向離心管內(nèi)加1 mL 75%乙醇清洗，7 500 r/min離心5 min;倒去上清，輕甩，用吸水紙吸干離心管壁上的液體，每管加入20 μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒（iScriptTM cDNA Synthesis Kit）的說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：SsoFastTM EvaGreen Supermix（2×） ? 10 μL，上游引物（10 μM）0.8 μL，下游引物（10 μM）0.8 μL，cDNA 1.5 μL，無RNase水6.9 μL，反應(yīng)總體系為20 ?L。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，50 ℃～ 60 ℃梯度退火20 s;循環(huán)35次;收集溶解曲線65 ℃升高到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.2.3 熒光定量PCR標準曲線的建立

以BEF疫苗為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化后克隆于pMD18-T載體。對重組質(zhì)粒進行酶切及測序鑒定。將構(gòu)建成功的標準質(zhì)粒按10倍梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用不同稀釋度的樣本作為擴增模板;以X軸為標準質(zhì)粒的起始模板量，以Y軸為熒光定量PCR獲得的循環(huán)數(shù)，繪制BEFV的熒光定量PCR標準曲線。

1.2.4 臨床樣本的檢測

用建立的熒光定量PCR檢測規(guī)?；鏊蜋z的臨床癥狀疑似牛流行熱感染的20份牛新鮮血液樣本，以了解該病在云南省牛場的感染情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴增鑒定

提取BEF疫苗中的疫苗毒株RNA，用所設(shè)計的特異性引物反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR擴增，根據(jù)優(yōu)化過的反應(yīng)體系及引物的退火溫度，擴增所得目的片段與預(yù)期擴增片段大小308 bp相符，圖1是電泳結(jié)果。

2.2 構(gòu)建BEFV 熒光定量PCR的標準曲線

BEFV溶解曲線峰值均單一，在陰性對照中，沒有發(fā)現(xiàn)特異性擴增，可知引物特異性良好;分析顯示：R2>0.99，0.9≤E≤1.1，35個循環(huán)內(nèi)既沒有擴增非特異性產(chǎn)物，也沒有產(chǎn)生引物二聚體，說明構(gòu)建標準曲線成功。陽性質(zhì)粒擴增后提取濃度為162 ng/μL，目的片段長度為308 bp，經(jīng)計算得到質(zhì)?？截惲繛?.91×10-10，證明所建立的熒光定量PCR方法可進行絕對定量分析。標準曲線如圖2所示。

2.3 臨床樣本檢測

利用建立的熒光定量PCR方法檢測了大理州2家規(guī)?；鏊蜋z的20份疑似牛流行熱感染的血液樣本，檢測顯示陽性樣本15份，證明建立的熒光定量PCR檢測方法可用于臨床試驗以及BEFV流行病學調(diào)查等。部分樣本檢測結(jié)果如圖3所示。

3 ?討論

牛流行熱是牛（主要為奶牛）的一種急性、熱性、病毒性傳染病，在我國曾有幾次波及20個以上省、直轄市和自治區(qū)的大流行。該病危害奶牛的健康，導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少，還會導(dǎo)致牛不能正常走動，從而損失經(jīng)濟價值，牛群一旦感染會快速大范圍發(fā)病，造成巨大損失[8-9]。疾病的診斷要早和快，防治該病的前提條件是能否對該病建立快速、準確的檢測。我國目前對該病的各種檢測方法研究不足，且操作麻煩，既耗費時間又浪費精力。因此，建立一種快速準確且經(jīng)濟實惠的實驗室診斷方法尤為迫切[10]。

本文通過反應(yīng)條件優(yōu)化、特異性檢測和靈敏度檢測，成功建立了BEFV 熒光定量PCR檢測方法。應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對云南部分地區(qū)送檢病料進行檢測分析，20份樣本中陽性樣本有15份，陽性率達75%，說明當前牛流行熱在牛場廣泛流行，我們應(yīng)對該病給予一定的關(guān)注。本次試驗建立的牛流行熱檢測方法可以為該病的實驗室檢測提供技術(shù)支持和參考。

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