鴨坦布蘇病毒病的研究進(jìn)展

黃允真 ，孫敏華 ，廖 明

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥與診斷學(xué)科群廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000；3. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東 廣州 510640）

2010年春季，我國(guó)江浙地區(qū)暴發(fā)了一種以蛋鴨產(chǎn)蛋率急速下降為主要特點(diǎn)的新發(fā)動(dòng)物傳染性疾病，依據(jù)其病變特點(diǎn)，該病被稱為鴨出血性卵巢炎（Duck Hemorrhagic Ovaritis, DHO），隨后經(jīng)系統(tǒng)研究，確定其病原為鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu Virus, DTMUV）。DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒恩塔亞病毒群。黃病毒是一類重要的人獸共患病原，同屬的病原包括西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、登革熱病毒（Dengue virus,DENV）、黃熱病毒（Yellow fever virus, YFV）、寨卡病毒（Zika virus）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）等，每年可造成數(shù)百萬(wàn)人感染。蚊媒傳播是許多黃病毒的主要傳播方式，而且在自然界中許多鳥類是多種黃病毒（如WNV）的擴(kuò)增宿主。目前，尚未有報(bào)道表明DTMUV對(duì)人表現(xiàn)出致病性，但已有研究表明DTMUV可以感染人。該病毒最早于1955年在馬來(lái)西亞的庫(kù)蚊樣品中被分離鑒定［1］，但隨后鮮有對(duì)該病毒的報(bào)道。2000年，馬來(lái)西亞發(fā)現(xiàn)TMUV引起的以腦炎和發(fā)育遲緩為主要特征的傳染病。直到2010年，我國(guó)部分地區(qū)鴨群暴發(fā)了坦布蘇病毒病，隨后迅速擴(kuò)散至全國(guó)，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。之后東南亞地區(qū)相繼暴發(fā)坦布蘇病毒病。鴨坦布蘇病毒病在我國(guó)突然暴發(fā)的原因目前尚未清楚。目前已發(fā)現(xiàn)的TMUV毒株根據(jù)其基因組特點(diǎn)可分為2個(gè)譜系，分別為TMUV和DTMUV。TMUV譜系的毒株主要分離自蚊蟲。DTMUV流行至今已進(jìn)化出3個(gè)群，其中1群主要在馬來(lái)西亞及泰國(guó)等東南亞地區(qū)流行，2.1亞群主要流行于中國(guó)和泰國(guó)，2.2亞群和3群主要在中國(guó)流行［2］。坦布蘇病毒病現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一，加之其為黃病毒屬病毒，具有潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)DTMUV進(jìn)行深入研究具有重要意義。本文就近年來(lái)DTMUV的病原學(xué)、流行特點(diǎn)、病毒感染引起的天然免疫反應(yīng)，以及疫苗研制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為DTMUV的深入研究及該病的綜合防控提供借鑒。

1 病原學(xué)

DTMUV粒子呈球形，直徑約45 nm，成熟的病毒粒子外層具有含糖蛋白纖突的磷脂雙分子層囊膜。DTMUV的基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為10 991個(gè)核苷酸，由5'非編碼區(qū)（UTR）、一個(gè)開放性閱讀框（ORF）和3'UTR組成。5'UTR長(zhǎng)度為94～96個(gè)核苷酸，具有1型cap結(jié)構(gòu)；3'UTR長(zhǎng)度為618～619個(gè)核苷酸，無(wú)poly A結(jié)構(gòu)。黃病毒通常以cap依賴方式進(jìn)行翻譯，研究表明，DTMUV可以通過(guò)不依賴cap方式在各類易感細(xì)胞內(nèi)翻譯，與依賴內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribosome entry site，IRES）介導(dǎo)的翻譯機(jī)制不同，其依賴于順式作用的5'UTR和3'UTR［3］。5'UTR和3'UTR呈高度結(jié)構(gòu)化，與病毒蛋白翻譯及基因組復(fù)制相關(guān)。DTMUV的ORF長(zhǎng)度為10 278個(gè)核苷酸，編碼產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)為3 425個(gè)氨基酸的多肽，在宿主和病毒蛋白酶的作用下水解為3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM、E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。C蛋白為核衣殼蛋白，能與病毒核酸組裝成核衣殼顆粒，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［4］。此外，黃病毒C蛋白還與病毒的復(fù)制能力、致病性有關(guān)［5-6］。黃病毒prM蛋白在病毒的組裝、釋放中發(fā)揮重要作用。prM蛋白是M蛋白的前體，在未成熟無(wú)感染性的病毒粒子上，prM的螺旋區(qū)與E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)相互作用形成異源二聚體，然后在蛋白酶的作用下水解為M蛋白，形成成熟的病毒粒子［7］。E蛋白是病毒的重要毒力蛋白，也是重要的免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體［8］。研究表明，E蛋白在介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合、病毒的組織嗜性、神經(jīng)毒性及致病力等方面有著重要影響［9-11］。NS1屬于分泌型糖蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生非中和性抗體，與病毒的復(fù)制、組裝和感染相關(guān)［12-13］。黃病毒NS2A和NS2B相互作用形成蛋白酶復(fù)合體，主要功能是對(duì)病毒多聚蛋白進(jìn)行剪切，此外還與病毒核酸的合成有關(guān)［14］。同時(shí)，DTMUV的NS2A/2B蛋白還可抑制RIG-1、MDA5-、MAVS-和STING指導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄［15］。NS3與NS2B和NS5相互作用，發(fā)揮RNA解旋酶和RNA聚合酶的作用［16］。酵母雙雜交試驗(yàn)表明，NS3的HELICc結(jié)構(gòu)域可以與PRDX1結(jié)合，調(diào)節(jié)p38 /絲裂原激活的蛋白激酶途徑，抑制細(xì)胞凋亡，可能有助于DTMUV逃避宿主免疫反應(yīng)［17］。NS4A和NS4B在病毒復(fù)制和病毒-宿主相互作用中起多種作用，如誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重排、調(diào)節(jié)病毒復(fù)制復(fù)合物形成、調(diào)節(jié)NS3解旋酶活性和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬等［18］。NS5為黃病毒中最保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，含有甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性，負(fù)責(zé)病毒RNA復(fù)制和RNA 5'端加cap［19］。

DTMUV可以在多種來(lái)源的細(xì)胞上傳代培養(yǎng)，如禽源的DEF、CEF、DF-1細(xì)胞，哺乳動(dòng)物源的BHK-21、Vero、HeLa細(xì)胞，蚊源的C6/36細(xì)胞等。病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）取決于病毒毒株、細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件。經(jīng)尿囊腔接種DTMUV的雞胚或鴨胚會(huì)在2～6 d后出現(xiàn)死亡［20-22］。與多數(shù)有囊膜病毒一樣，DTMUV對(duì)乙醚、氯仿和過(guò)氧膽酸鹽敏感，不耐酸堿，不耐熱，56 ℃ 15 min即可滅活。

2 流行特點(diǎn)

2.1 宿主范圍

DTMUV具有廣泛的天然宿主，包括蚊子、鴨、雞、鵝、鴿子、麻雀等［23］。DTMUV在流行之初主要感染蛋鴨和種鴨，鴨感染后主要表現(xiàn)為采食量下降、拉綠色稀糞、產(chǎn)蛋量急劇下降等臨床特征。蛋鴨一般在感染后第2天開始表現(xiàn)出采食量下降，隨后在5～6 d內(nèi)產(chǎn)蛋率可下降至10%以下，部分病鴨伴隨有神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為雙腳麻痹、搖頭晃腦。該病病程約數(shù)周，蛋鴨一般可耐過(guò)，但耐過(guò)蛋鴨的產(chǎn)蛋性能通常無(wú)法恢復(fù)到正常水平［24］。肉鴨通常在15～35日齡發(fā)病，同樣表現(xiàn)為采食量下降、拉綠色稀糞、雙腳麻痹、步態(tài)不穩(wěn)，通常感染后4～7 d為死亡高峰，耐過(guò)肉鴨通常表現(xiàn)為發(fā)育不良。剖檢病死蛋鴨可見卵巢出血性壞死、萎縮，卵泡出血、萎縮、破裂；公鴨睪丸、輸精管萎縮；部分病鴨肝臟發(fā)黃、腫大，脾臟腫大甚至破裂，也有部分鴨脾臟萎縮，心肌蒼白，有時(shí)可見條索狀壞死，多臟器漿膜表面可見紅染小體［24］。

種鵝感染DTMUV的潛伏期一般為3～5 d，主要表現(xiàn)為采食量下降，體溫升高，產(chǎn)蛋量急劇下降60%～80%，后期神經(jīng)癥狀明顯，表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)，頭頸抽搐，翅膀麻痹，步態(tài)不穩(wěn)甚至癱瘓，死淘率為5%～10%，種鵝耐過(guò)后產(chǎn)蛋性能一般無(wú)法恢復(fù)到正常水平［25］。感染DTMUV的蛋雞表現(xiàn)出產(chǎn)蛋量下降，但通常不會(huì)死亡，臨床未發(fā)現(xiàn)大規(guī)模流行［26］。此外，研究人員還在發(fā)病鴨場(chǎng)周圍捕獲的麻雀肝臟及泄殖腔中也檢測(cè)到DTMUV［27］。

DTMUV除了有廣泛的禽類宿主外，還可感染哺乳動(dòng)物。有研究人員將DTMUV通過(guò)顱內(nèi)接種感染小鼠，感染后的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)癥狀甚至死亡［28］。此外，有研究人員還在鴨場(chǎng)員工的血清中檢測(cè)到DTMUV中和抗體，表明DTMUV可在鴨-人之間傳播［29］，雖未表現(xiàn)出致病性，但仍應(yīng)引起足夠重視。

2.2 傳播途徑

大多數(shù)黃病毒屬病毒（如登革熱病毒、乙型腦炎病毒）主要通過(guò)蚊、蜱等吸血性節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行傳播。但DTMUV病的暴發(fā)沒(méi)有明顯季節(jié)性，即使在蚊蟲不活躍的秋冬季也時(shí)常發(fā)生，說(shuō)明蟲媒傳播并不是DTMUV的主要傳播途徑［30］。有研究人員在山東田間的庫(kù)蚊中分離到1株TMUV，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該毒株與DTMUV同源性較高［20］。此外，已證實(shí)DTMUV可以通過(guò)庫(kù)蚊感染雞，但并不是所有種類的庫(kù)蚊都具備傳播性［31］。目前，蟲媒在DTMUV傳播中的作用有待進(jìn)一步明確。

水平傳播是DTMUV在鴨群或鵝群中傳播的主要途徑，患病鴨可通過(guò)排泄物或呼出的氣溶膠傳播病毒［32-33］。研究顯示，DTMUV的E蛋白在病毒的水平傳播中起重要作用，而E蛋白第154位氨基酸糖基化的缺失可使病毒喪失水平傳播能力［11］。野生鳥類在DTMUV的跨地域傳播中可能起重要作用。事實(shí)上，因?yàn)轼B類特殊的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，其作為擴(kuò)增宿主在許多黃病毒的傳播中起著重要作用，例如WNV、JEV等在傳播至人類之前就已經(jīng)在鳥類宿主中得到擴(kuò)增［34］?；趯?duì)麻雀感染DTMUV的研究，我們推測(cè)攜帶DTMUV的野生鳥類在遷徙過(guò)程中通過(guò)糞-口傳播途徑將病毒傳播至各處。但DTMUV具體在鴨群間如何傳播還有待進(jìn)一步研究。

3 DTMUV感染的天然免疫反應(yīng)研究

宿主的天然免疫反應(yīng)在早期抵御病毒感染中發(fā)揮重要作用。模式識(shí)別受體（PRRs）存在于細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)體中，包括Toll樣受體（TLR）、RIG-I樣受體（RLR）、NOD樣受體（NLR）、C型凝集素受體（CLR）和AIM2樣受體（ALR）等。它們能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式（PAMPs），激活免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-I和炎性細(xì)胞因子等，進(jìn)而誘導(dǎo)多種干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)從而發(fā)揮抗病毒作用。

3.1 PRRs介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)

RLRs包 括 MDA5、LGP2和 RIG-I。RLRs存在于細(xì)胞質(zhì)中，可識(shí)別RNA病毒的復(fù)制中間產(chǎn)物，如dsRNA或5'端三磷酸化RNA，隨后激活MAVS觸發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-I和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［35］。而其中LGP2無(wú)法自主傳導(dǎo)信號(hào)，在RIG-I介導(dǎo)的通路中起調(diào)節(jié)作用。值得注意的是，LGP2起初被認(rèn)為在通路中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，但越來(lái)越多研究表明，LGP2可在RLR信號(hào)傳導(dǎo)中起正反饋調(diào)節(jié)作用［36］。目前已鑒定的鴨源TLR有5種，為TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7。其中TLR2、TLR4、TLR5主要位于細(xì)胞膜上，識(shí)別細(xì)菌、真菌等的PAMPs，TLR3識(shí)別dsRNA，TLR7識(shí)別ssRNA。激活的TRL2、TRL7募集MyD88啟動(dòng)MyD88依賴的信號(hào)通路，進(jìn)而激活I(lǐng)RF-1誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-I；TLR3通過(guò)募集TRIF啟動(dòng)TRIF依賴的信號(hào)通路，從而激活NF-κB和IRF7，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-I和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

DTMUV感染1日齡櫻桃谷鴨，在感染后24、48、72 h分別分析腦和脾臟中TRL3轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果顯示，腦組織中TRL3轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，并在48 h達(dá)到高峰（13.62倍），RIG-I和MDA5分別在感染后48、72 h達(dá)到峰值（分別為4.13倍和20.60倍）；脾臟中TRL3轉(zhuǎn)錄水平在感染后24、48、72 h分別上調(diào)18.34、1.57、0.81倍，RIG-I和MDA5也分別在感染后48、72 h達(dá)到峰值（分別為13.62倍和18.77倍）。這表明RIG-I、MDA5、TLR3介導(dǎo)的通路在不同的感染時(shí)期發(fā)揮著協(xié)同作用［37］。體外感染研究也表明，DTMUV可上調(diào)CEF細(xì)胞或293T細(xì)胞中的MDA5、RIG-I和TLR3表達(dá)，從而誘導(dǎo)IFN-β、IL-28A/B、IL-29的表達(dá)。同時(shí)，一些關(guān)鍵的ISGs表達(dá)水平也顯著提高。而敲低MDA5或TLR3的細(xì)胞感染DTMUV后，IFN-β、IL-28A/B和IL-29的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)比正常細(xì)胞顯著降低［38］。同樣，過(guò)表達(dá)MAVS可有效抑制DTMUV的復(fù)制［39］。對(duì)感染DTMUV母鴨的卵泡進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果也顯示，RLR、TLR通路參與了抗DTMUV感染過(guò)程［40］。此外，Zhang等［41］對(duì)感染DTMUV的雛鴨腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，LGP2的轉(zhuǎn)錄水平在感染后12、24、48 h均上調(diào)，而MDA5、TLR2和TLR3轉(zhuǎn)錄水平僅在感染后24 h上調(diào)，RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著變化，其中LGP2上調(diào)倍率最高。這表明了LGP2在抗DTMUV感染中可能起重要作用。LGP2在MDA5介導(dǎo)的抗鴨腸炎病毒（DEV）感染中起到雙向調(diào)節(jié)作用［42］，因此LGP2在抗DTMUV感染中起何種作用尚無(wú)定論，有待進(jìn)一步深入研究。值得注意的是，Zhang等［41］的研究中，病毒感染并未改變鴨腦組織中RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平，這與其他已發(fā)表的研究結(jié)果存在差異，可能與鴨品種和毒株有關(guān)，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。除了RLR和TLR介導(dǎo)的信號(hào)通路，NLR、CLR、HMGB、DDX3X 等介導(dǎo)的信號(hào)通路同樣參與了DTMUV的感染過(guò)程［41,43-45］，但具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3.2 ISGs抗DTMUV感染的研究

Zhang等［41］在對(duì)感染DT M UV的雛鴨腦組織轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，至少有22個(gè)ISGs存在轉(zhuǎn)錄 上 調(diào)， 其 中 IFIT5、Mx、OASL、VIPERIN和ZC3HAV1已被證實(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮抗病毒作用［46］。而IFIT5、OASL、VIPERIN轉(zhuǎn)錄水平至少在感染后12、24、48 h其中一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)了200倍以上。IFIT5是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白，過(guò)表達(dá)IFIT5的細(xì)胞在感染后24 h，DTMUV滴度顯著降低，但感染后48 h的病毒滴度顯著增加，而敲低IFIT5則得到相反的結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)IFIT5可顯著抑制NF-κB和IRF7以及下游IFN誘導(dǎo)干擾素刺激的反應(yīng)元件（ISRE）啟動(dòng)子的激活，同時(shí)抗病毒蛋白Mx的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)［47］。Mx是一種抗粘液病毒蛋白，敲低或過(guò)表達(dá)該蛋白影響DTMUV的復(fù)制［48］。OASL蛋白屬于OAS蛋白家族，在許多病毒感染過(guò)程中顯示出廣泛的抗病毒能力［49］。有研究克隆了櫻桃谷鴨的OASL蛋白，體外研究表明，在DF-1細(xì)胞中鴨OASL過(guò)表達(dá)會(huì)輕微抑制DTMUV復(fù)制，而敲低鴨OASL會(huì)增加細(xì)胞中DTMUV復(fù)制［50］。VIPERIN是一種自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶，在抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮多方面作用［51］。鴨VIPERIN已被證實(shí)可抑制BHK-21細(xì)胞和DEF細(xì)胞中DTMUV的出芽［52-53］。IFITM1和IFITM3的過(guò)表達(dá)也能抑制DF-1細(xì)胞中DTMUV的復(fù)制［54］。此外，轉(zhuǎn)錄組分析還發(fā)現(xiàn)多種ISGs參與了DTMUV感染過(guò)程，其中一些基因已被證實(shí)在其他黃病毒感染中發(fā)揮著重要的抗病毒作用［43,55］，但是這些ISGs在抗DTMUV中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

3.3 免疫逃逸

盡管DTMUV感染可激活PRRs介導(dǎo)的免疫通路，但在一些感染研究中，DTMUV可以分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上抑制IFN-I的表達(dá)［56］。DTMUV感染DEF細(xì)胞會(huì)下調(diào)miR-148a-5p的產(chǎn)生，從而上調(diào)SOCS1的表達(dá)，進(jìn)而抑制IFN-I的產(chǎn)生并促進(jìn)病毒復(fù)制［57］。同時(shí)還會(huì)上調(diào)miR-221-3p的產(chǎn)生，導(dǎo)致SOCS5表達(dá)下調(diào)，抑制IFN-β的表達(dá)從而促進(jìn)病毒復(fù)制［58］。自噬也是黃病毒逃逸宿主免疫反應(yīng)的重要途徑，DTMUV感染鴨可引起各組織中的細(xì)胞自噬，使用自噬抑制劑可抑制DTMUV復(fù)制并減輕DTMUV引起的病理癥狀，而自噬誘導(dǎo)劑的治療則產(chǎn)生相反作用。同時(shí)，自噬還會(huì)影響PRRs、IFN-I及其他細(xì)胞因子的表達(dá)。表明自噬促進(jìn)了DTMUV復(fù)制，加劇了病理癥狀的發(fā)展，并可能抑制宿主體內(nèi)的天然免疫應(yīng)答［59］。以DEF細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)DTMUV感染可以增加LC3-II的表達(dá)，而多聚泛素結(jié)合蛋白螯合體1（p62）表達(dá)下調(diào)，證實(shí)了DEF細(xì)胞中發(fā)生了完全自噬，并且自噬抑制NF-κB和IRF7的激活，增強(qiáng)了DTMUV復(fù)制［60］。DTMUV利用多種機(jī)制拮抗宿主細(xì)胞機(jī)制以促進(jìn)復(fù)制，病毒復(fù)制依賴于宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），并誘導(dǎo)產(chǎn)生ER應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞未折疊蛋白應(yīng)答（UPR）的激活。已有研究表明，黃病毒可通過(guò)UPR減輕由病毒蛋白積累引起的ER應(yīng)激，并使ER擴(kuò)增，避免細(xì)胞凋亡，從而有利于病毒復(fù)制［61］。

4 DTMUV疫苗研制

4.1 弱毒疫苗

DTMUV可在多種細(xì)胞及胚體上傳代培養(yǎng)，因此該病毒的致弱手段多種多樣。Li等［62］將臨床分離株FX2010在CEF細(xì)胞上連續(xù)傳代180代，獲得FX2010-180P弱毒株，研究證明，該弱毒株免疫原性優(yōu)良，安全性可靠，目前已開發(fā)為成熟的商品化疫苗，并在生產(chǎn)中取得了良好效果［62］。此外，研究人員還在雞胚、鴨胚、DF-1、BHK-21等生物材料上成功獲得了多株免疫原性良好、安全性高的減毒疫苗候選毒株［63-65］。目前，已經(jīng)培育多株候選疫苗株，而如何在保證免疫原性和安全性的基礎(chǔ)上提高弱毒株的效價(jià)、降低生產(chǎn)成本是后續(xù)弱毒疫苗研究的重點(diǎn)。

4.2 滅活疫苗

相較于弱毒疫苗，滅活疫苗在安全性上更有保障。目前商品化的DTMUV滅活疫苗有HB株滅活疫苗，并且同樣廣泛應(yīng)用于臨床生產(chǎn)中［66］。但滅活疫苗免疫原性低于弱毒疫苗，往往需要多次免疫才能達(dá)到令人滿意的效果。研究人員用β-丙內(nèi)酯作為滅活劑制備DTMUV滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)相比甲醛滅活，該疫苗的免疫效力更高［67］。佐劑的使用是增強(qiáng)疫苗免疫效力的重要手段，例如將滅活疫苗與CpG ODNs佐劑聯(lián)用，免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，CpG ODNs佐劑可顯著提高機(jī)體血清血凝抑制（HI）抗體滴度、DTMUV抗體的陽(yáng)性率、血清細(xì)胞因子濃度和保護(hù)效力［68］。此外，張聰?shù)龋?9］評(píng)估了重組融合肽Tα1-BP5對(duì)DTMUV滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用，結(jié)果表明，rTα1-BP5能顯著增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答水平。雖然佐劑的使用可以有效提高DTMUV滅活疫苗的免疫效力，但也意味著疫苗成本增加，在實(shí)際臨床使用中難以推廣。因此，滅活疫苗的研究應(yīng)以選育免疫原性強(qiáng)、培養(yǎng)效價(jià)高的毒株為主。

4.3 基因工程疫苗

在DTMUV疫苗研究中，DNA疫苗是研究的一個(gè)重要方向。將DTMUV的prM/E基因克隆至pVAX1載體，同時(shí)在載體中引入用以提高免疫效力的CpG基序，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-prM/E-CpG。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，pVAX1-prM/E-CpG可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，攻毒保護(hù)率可達(dá)100%［70］。有研究將DTMUV的C基因克隆至pVAX1載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-C，經(jīng)口服免疫后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且能有效保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)毒攻擊；進(jìn)一步利用沙門氏菌SL7207株為載體口服遞送pVAX1-C，同樣可為機(jī)體提供良好的免疫保護(hù)，該方法經(jīng)濟(jì)有效，具有大規(guī)模臨床應(yīng)用前景［4］。

嵌合疫苗是一種通過(guò)改造病原體并構(gòu)建表達(dá)多種病原抗原的載體而制備成的疫苗。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所以新城疫病毒（NDV）GM株為載體構(gòu)建表達(dá)DTMUVprM/E基因的嵌合病毒aGM/prM+E，動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，aGM/prM+E能針對(duì)NDV和DTMUV強(qiáng)毒的攻擊提供有效保護(hù)［71］。以鴨腸炎病毒（D EV）為載體，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建同時(shí)表達(dá)H5N1禽流感病毒（AIV）HA基因和DTMUVprM/E基因的重組DEV（C-KCE-HA/PrM-E），動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，單劑量的C-KCE-HA/PrM-E即可使鴨抵抗H5N1、DTMUV和DEV攻擊［72］。此外，該單位還利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)并制備了表面展示DTMUV E蛋白和H3N2 HA2蛋白的重組嵌合AIV VLPs（VLPs E-HA），試驗(yàn)證實(shí)其具有良好的免疫原性［73］。腺病毒載體是目前應(yīng)用最廣泛的疫苗載體之一，研究人員構(gòu)建了表達(dá)DTMUV E蛋白的重組腺病毒rAd-E，免疫攻毒試驗(yàn)顯示，rAd-E雖不能為鴨提供100%的免疫保護(hù)，但存活率高于對(duì)照組，這可能與免疫次數(shù)和劑量有關(guān)［74］。不同種類的疫苗聯(lián)合使用有助于免疫效果的提升，利用表達(dá)prM-E或E的減毒沙門活疫苗和重組腺病毒載體疫苗進(jìn)行異源初免—加強(qiáng)免疫，其免疫效果強(qiáng)于同源初免—加強(qiáng)免疫［75］。

此外，亞單位疫苗也是DTMUV疫苗研究的熱點(diǎn)。E蛋白是DTMUV的主要抗原蛋白，DTMUV亞單位疫苗的研究也主要圍繞E蛋白展開。目前研究已證實(shí)，E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生 DTMUV 中和抗體［76-77］。Li等［78］用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)截短的E蛋白，免疫攻毒試驗(yàn)證明，截短的E蛋白能為鴨提供100%的免疫保護(hù)。為提高亞單位疫苗的免疫原性，研究人員將原核表達(dá)并純化的E蛋白與脂質(zhì)體混合制備成亞單位疫苗，免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，該亞單位疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的特異性抗體［79］。此外，目前已鑒定出了多個(gè)E蛋白B細(xì)胞表位，并證實(shí)了這些表位具有良好的免疫原性，為表位疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)［80］。盡管DTMUV亞單位疫苗的研究取得了一定進(jìn)展，但免疫原性和生產(chǎn)成本依然制約著DTMUV亞單位疫苗的臨床使用。

5 展望

鴨坦布蘇病毒病自暴發(fā)以來(lái)，對(duì)我國(guó)及東南亞地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病的防控以預(yù)防為主，目前商品化的疫苗包括WF100株弱毒疫苗、FX2010-180P株弱毒疫苗、HB株滅活疫苗。其中弱毒疫苗的安全性一直備受關(guān)注，但目前臨床使用的商品弱毒疫苗還未發(fā)現(xiàn)有明顯副作用，也沒(méi)有出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象。與弱毒疫苗相比，滅活疫苗安全性上更加可靠，但存在免疫程序繁瑣、保護(hù)率稍低等缺點(diǎn)。因此更加高效、安全、廉價(jià)的DTMUV疫苗的研發(fā)是今后疫苗研究工作的重點(diǎn)。目前，對(duì)DTMUV感染后宿主體內(nèi)免疫反應(yīng)分子機(jī)制的研究還不夠深入。隨著鴨全基因組測(cè)序的完成以及免疫相關(guān)基因注釋的完善，今后可聯(lián)合多組學(xué)分析和分子生物學(xué)手段，深入研究DTMUV與宿主的互作，闡明疾病的發(fā)生過(guò)程與免疫反應(yīng)機(jī)理，為靶向治療藥物開發(fā)及新型疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。