坤旭鋒，邵征績，章朝鈞，陳小軍，孫 杰，鄺 曦，龍治堅

（1 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2 西南科技大學(xué)竹類研究所）

藍(lán)莓隸屬于杜鵑花科越橘屬植物，又名越橘、越桔、藍(lán)漿果[1]。該植物原產(chǎn)于北美地區(qū)，在我國西南、東北以及長江流域的山區(qū)均有廣泛的分布[2-3]。藍(lán)莓的營養(yǎng)成分豐富，花青素含量較高，素有“漿果之王”的美譽[4]。我國藍(lán)莓的研究起步較晚，生產(chǎn)上的栽培品種仍然以歐美等國家的為主。其栽培品種主要屬于高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓3 個類群[1]。經(jīng)過幾十年的研究，我國藍(lán)莓在分子生物學(xué)方面的研究取得了階段性的進展。鑒于此，綜述藍(lán)莓的分子標(biāo)記研究進展，并對后續(xù)的研究進行展望。

1 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

近幾十年，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，已由RAPD、AFLP、ISSR、SSR 等隨機DNA 分子標(biāo)記類型發(fā)展到SCoT、SRAP、CDDP、EST-SSR 等目的基因分子標(biāo)記和功能性分子標(biāo)記類型[5]。這些標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于葡萄[6]、柑桔[7]、龍眼[8]等園藝作物遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定等方面。

2 分子標(biāo)記在藍(lán)莓中的應(yīng)用進展

2.1 遺傳多樣性與親緣關(guān)系

在藍(lán)莓的遺傳背景研究中，EST-SSR 標(biāo)記應(yīng)用相對較多。孫海悅等[9]開發(fā)越橘EST-SSR 引物，并分析其在越橘品種遺傳多樣性研究中的作用，結(jié)果表明：17對引物在供試越橘種質(zhì)中擴增出理想的PCR 產(chǎn)物，17對引物均有多態(tài)性；而在DICE 為0.69 處，供試的種質(zhì)資源聚為4 類。孫海悅等[10]擴大供試材料，再次利用EST-SSR 標(biāo)記分析遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)55 對引物在供試越橘種質(zhì)中擴增出清晰的條帶，且具有多態(tài)性。聚類發(fā)現(xiàn)在DICE 為0.70 處，供試越橘種質(zhì)分別聚為兩大類。孫英新等[11]利用EST-SSR 標(biāo)記研究6 個藍(lán)莓品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明：13 對引物共獲得65 條條帶，多態(tài)性條帶為53 條，比率為81.5%；PIC 為0.513～0.887，遺傳分化系數(shù)平均值為0.137，基因流的平均值為1.567。劉有春等[12]基于EST-SSR 標(biāo)記研究越橘栽培種和中國野生種的遺傳結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果表明：8 對引物共檢測101 個等位變異，平均為12.63，Ne、I、Ho、He 等遺傳多樣性指數(shù)平均值分別為8.711、2.262、0.523 和0.860。同時，越橘種質(zhì)資源內(nèi)部存在明顯的遺傳結(jié)構(gòu)差異，4 個類群與材料的抗寒性、低溫需冷量特性等有明顯的對應(yīng)關(guān)系。從國外引進的越橘栽培種和我國野生種間存在一定程度的基因交流。這說明國內(nèi)外的越橘種質(zhì)資源遺傳背景差異較大，但尚未形成生殖隔離，為雜交育種提供了豐富的親本選擇，也為該果樹種質(zhì)資源的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。耿金曼[13]利用EST-SSR標(biāo)記研究13 個蔓越橘品種的遺傳背景，結(jié)果表明：每個EST-SSR 位點的等位基因范圍在7～12 個，平均每對引物檢測到等位基因數(shù)為10.29 個；聚類分析發(fā)現(xiàn)13 個蔓越橘品種間的相似性系數(shù)范圍為0.28～1.00，并在相似系數(shù)為0.74 時，可將13 份蔓越橘材料分為4大組。郭瑞雪[14]基于55 對EST-SSR 引物分析越橘品種，結(jié)果表明：在遺傳相似系數(shù)（DICE）為0.81 處，84個供試品種聚為4 大類，其中半高叢越橘和高叢越橘聚為1 類；2 個高叢越橘品種聚為1 類；而矮叢越橘、兔眼越橘品種分別聚為1 類。同時，聚類結(jié)果基本與越橘的分類相一致。這表明EST-SSR 標(biāo)記可以用于藍(lán)莓種質(zhì)的鑒定與遺傳多樣性分析。

SRAP 標(biāo)記自開發(fā)以來，被用于數(shù)十種植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。在藍(lán)莓上也有相應(yīng)的應(yīng)用。傅冰等[15]以9 個品種藍(lán)莓為試材，優(yōu)化了藍(lán)莓SRAP-PCR 反應(yīng)體系，并利用該體系分析了供試藍(lán)莓品種之間的遺傳多樣性，結(jié)果表明：9 個品種藍(lán)莓的遺傳相似性系數(shù)在0.1818～1.0000 之間，平均為0.6359，說明材料存在較高的遺傳多樣性。UPGMA 聚類可將供試材料分為4 個類群，其結(jié)果與主坐標(biāo)分析相一致。張魯杰等[16]采用15 對SRAP 引物對21 個藍(lán)莓栽培品種進行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)21 個品種共獲得207 條帶，其中多態(tài)性條帶172 條，多態(tài)性比率83.1%。平均等位基因數(shù)為1.82，有效等位基因數(shù)為1.47，Nei's 基因多樣性指數(shù)為0.27，Shannon's 平均信息指數(shù)為0.41。UPGMA 聚類結(jié)果與已知藍(lán)莓雜交系譜基本相吻合。李紅俠等[17]利用SRAP 標(biāo)記，對來源不同的14 份藍(lán)莓種質(zhì)的親緣關(guān)系進行了分析，5 對SRAP引物共擴增96 條條帶，其中多態(tài)性條帶有71 條，多態(tài)性比率為73.96%。在相似系數(shù)為0.55，可將14 份藍(lán)莓分成3 類，第1 類有3 份種質(zhì)，第2 類有2 份種質(zhì)，第3 類共9 份種質(zhì)，聚類結(jié)果與形態(tài)分類的大致吻合。尹德潔[18]利用SRAP 標(biāo)記研究75 份藍(lán)莓和2 份紅豆越橘的遺傳背景，發(fā)現(xiàn)栽培品種的 DICE 介于0.5670～0.8774 之間；野生材料的DICE 范圍為0.6207～0.9387；而栽培與野生材料的DICE 則為0.3525～0.4751。進一步分析表明，DICE=0.57 處，供試材料聚為3 個類群，即栽培藍(lán)莓品種類群、野生藍(lán)莓類群以及紅豆越橘類群。聚類結(jié)果與材料的系譜、材料的類型存在一定的相關(guān)性。

除了EST-SSR 和SRAP 標(biāo)記以外，尚有其他標(biāo)記應(yīng)用于藍(lán)莓的遺傳背景研究。韓國輝等[1]為建立藍(lán)莓SCoT 標(biāo)記分析體系，對影響藍(lán)莓SCoT-PCR 反應(yīng)的Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 及引物等因素進行優(yōu)化篩選，建立了適用于藍(lán)莓遺傳分析的SCoT-PCR 擴增體系。房文秀等[19]基于CDDP 標(biāo)記，研究藍(lán)莓種質(zhì)資源，結(jié)果表明：在32 份供試材料中，17條CDDP 引物共擴增出207 條條帶，多態(tài)性條帶占比90.82%，特異條帶占比8.21%。同時，CDDP 標(biāo)記在藍(lán)莓中具有較高的多態(tài)性及特異性，與種質(zhì)的需冷量、抗寒性及果實顏色具有一定的相關(guān)性，2 條引物組合可以完全區(qū)分32 種藍(lán)莓，聚類分析也基本與形態(tài)學(xué)符合[20]。說明CDDP 標(biāo)記可應(yīng)用于藍(lán)莓種質(zhì)資源的鑒定、遺傳多樣性等領(lǐng)域的研究。方茜[21]基于SSR 和SSAP標(biāo)記，鑒定52 份越橘屬種質(zhì)，并對其進行親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明野生高叢藍(lán)莓參與了兔眼藍(lán)莓的選育。

2.2 種質(zhì)資源鑒定與指紋圖譜構(gòu)建

隨著品種選育、種質(zhì)交流和引種栽培等工作的推進，難免會出現(xiàn)同物異名或同名異物的現(xiàn)象[5]。這給種質(zhì)資源的鑒定帶來了挑戰(zhàn)?；诜肿訕?biāo)記對種質(zhì)資源進行鑒定，并構(gòu)建指紋圖譜可有效解決這些問題。李昱[22]環(huán)用ISSR 標(biāo)記對種質(zhì)資源進行鑒定，結(jié)果表明：9條引物擴增出DNA 譜帶54 條，每條引物平均有6 條，其中有35 條為多態(tài)條帶，平均多態(tài)性比率為65%；條帶大小介于200～2000bp 之間。諶月[23]運用ISSR 標(biāo)記研究變異材料，ISSR-PCR 擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變異株和對照相比，存在特異性條。變異材料“A1”“A2”和“A3”與對照材料“V3”的DICE 系數(shù)分別為0.800、0.711 和0.722；變異材料“L1”和“L2”與對照“Legacy”的DICE系數(shù)分別為0.800 和0.767；變異材料“B1”、“B2”和“B3”與對照“南好”的DICE 則為：0.633、0.589 和0.578。鄭姍等[24]利用ISSR 研究17 個藍(lán)莓品種，結(jié)果表明：17 個藍(lán)莓品種的遺傳相似系數(shù)為0.66～0.86，在0.69 的水平可分為4 個品種群；基于UBC825 和UBC862 引物，初步構(gòu)建了指紋圖譜。該圖譜可以將供試的材料區(qū)分開，為藍(lán)莓品種的鑒定提供技術(shù)支持。這表明ISSR 分子標(biāo)記可以用于藍(lán)莓的種質(zhì)資源鑒定和突變體篩選。徐國輝等[25]基于EST-SSR 標(biāo)記研究8 個自然雜交藍(lán)莓優(yōu)良品系，結(jié)果表明：10 對引物組合共檢測出23 個等位基因，平均為2.3 個，Shannon 多樣性指數(shù)均值為0.7003；基于CA94 和CA23 引物構(gòu)建了供試材料的DNA 指紋圖譜。高雄梅等[26]從40 對EST-SSR 引物中篩選多態(tài)性良好的引物組合，分析藍(lán)莓的品種。結(jié)果表明：10 對引物共擴增出206 個位點，其中多態(tài)性位點203 個，占98.12%。每條引物的多態(tài)性位點數(shù)為9～48 個，平均每條引物擴增出20.6 個位點，平均多態(tài)性位點為20.3 個。同時，構(gòu)建了30 個北高叢藍(lán)莓栽培品種的指紋圖譜，在遺傳相似系數(shù)為0.52 時，30 個品種聚為1 類，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.63時，77.7%的品種仍聚為1 類。郭照東等[27]利用SSR 標(biāo)記研究越橘22 份栽培品種的遺傳背景，結(jié)果表明：核心引物NA961 和NA1040 組合構(gòu)建了22 個越橘品種的指紋圖譜，并能夠完全區(qū)分22 個越橘品種。這為藍(lán)莓種質(zhì)資源的評價、鑒定、管理及藍(lán)莓新品種的培育奠定了基礎(chǔ)，也為分子輔助育種和保護該優(yōu)良品系提供科學(xué)依據(jù)[28]。

3 展望

我國藍(lán)莓的分子生物學(xué)研究取得了一定的進展，但仍然滯后于其他園藝作物。在后續(xù)的研究中，應(yīng)該加大研究力度。筆者認(rèn)為，在未來的研究中，可以加強這幾方面的研究。一是加強功能性標(biāo)記，如SCoT、SRAP標(biāo)記在藍(lán)莓中的應(yīng)用；二是加強種質(zhì)的鑒定與指紋圖譜的構(gòu)建；三是構(gòu)建藍(lán)莓的分子遺傳連鎖圖譜。四是加強功能基因的定位、克隆，推進分子輔助育種。