孫玉琴，黃培，張睿，鄒淑花

(1.山東省淄博市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，淄博 255029；2. 上海國際和平婦幼保健院生殖中心，上海 200030)

在正常婦女的自然月經周期中，血清雌二醇(E2)的濃度隨著卵泡的生長逐漸增加，排卵前達到第1個峰值，在黃體生成素(LH)峰后血中的E2濃度迅速下降，排卵后形成黃體，同時分泌雌激素使E2濃度再次上升，到黃體中期形成第2個峰值，雌、孕激素按照一定的規(guī)律和比例合成分泌，共同作用于子宮內膜，為胚胎植入做準備。在IVF-ET過程中，應用外源性激素來促進多個卵泡發(fā)育，使血清E2濃度急劇升高，但在取卵過程中隨著顆粒細胞的丟失，血清E2的濃度又驟降，所以血清E2濃度是控制性促排卵(COH)過程中重要的監(jiān)測指標，它不僅反映卵泡的生長發(fā)育狀態(tài)，指導臨床用藥，而且影響子宮內膜的容受性與胚胎著床[1]。因此探究IVF-ET過程中血清E2濃度的變化至關重要，目前國內外關于E2濃度的變化對臨床結局的影響無統(tǒng)一觀點，而且尚無HCG日至胚胎移植日連續(xù)6 d血清E2濃度的監(jiān)測。因此本研究監(jiān)測自HCG日起連續(xù)6 d血清E2濃度的變化曲線及其預測妊娠結局的價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析自2017年1月至2020年1月在淄博市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心接受IVF-ET治療的正常卵巢功能的不孕癥患者41例(41個周期)。納入標準：(1)選取同一臨床醫(yī)師的患者；(2)藥物使用劑量按照科室制定的SOP手冊實施；(3)對促排卵藥物正常反應者。(4)黃體期長方案鮮胚移植者；(5)年齡<40歲，主要不育因素為輸卵管因素、排卵障礙、男方因素；(6)夫婦染色體正常，免疫學檢查正常，孕期無感染史；(7)自愿接受自HCG日起連續(xù)6 d測定E2濃度者。排除標準：自HCG日起至移植日服用雌激素相關藥物者。本研究已通過淄博市婦幼保健院醫(yī)學倫理審查批準。

二、研究方法

1.輔助生殖(ART)方案：所有研究對象均采用黃體期長方案，在黃體中期(子宮內膜為C型，E2>183.5 pmol/L，孕酮>15.9 nmol/L)時使用0.1 mg促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達菲林，Ferring，德國)降調節(jié)，14～21 d達到降調節(jié)標準(內膜厚度<4～5 mm、LH<5 U/L、E2<183.5 pmol/L，無功能性囊腫)，依據個體化使用合適劑量的促性腺激素(Gn)啟動，根據卵泡數量、卵泡生長速度及激素水平來調整Gn用量。當B超顯示3個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm，平均每個優(yōu)勢卵泡的E2濃度在734～1 101 pmol/L時停用Gn，并在當晚肌肉注射HCG注射液(HCG，注射用絨促性素，珠海麗珠制藥)8 000～10 000 U，自HCG日起連續(xù)6 d測定血清E2濃度并分別記為d0E2、d1E2、d2E2(取卵日)、d3E2、d4E2和d5E2(胚胎移植日)。于HCG注射后36～38 h取卵(OPU)，OPU后給予黃體支持，將取出的卵子置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，卵子進一步成熟后加入精液繼續(xù)培養(yǎng)，OPU后第3天移植Ⅱ級7細胞以上胚胎1～2個。

2.胚胎形態(tài)學評級及優(yōu)質胚胎評定：根據胚胎的卵裂球數目、形態(tài)、胞質顆粒及胞質形態(tài)等按胚胎的形態(tài)學評級法將胚胎分為I～IV級[2]。根據本中心的SOP手冊評定優(yōu)質胚胎：取卵后第1天觀察原核為正常受精，第3天評級為I級、II級，卵裂球7～8個且碎片率<20%的胚胎。

3.激素的實驗室檢測及基礎竇卵泡數(AFC)的監(jiān)測：每位患者在月經期第3～5天清晨8：00～9：00抽靜脈血3～5 ml測定基礎性激素六項及經陰道超聲監(jiān)測基礎AFC數目；自HCG日起連續(xù)6 d于每日清晨8：00～9：00抽靜脈血3～5 ml測定血清E2濃度。均使用西門子原廠試劑盒及化學發(fā)光法進行檢測，均嚴格按照試劑盒及儀器的說明書進行操作。批內變異系數<5%，批間變異系數<10%。

4.妊娠結果判斷標準：移植胚胎后28～30 d經陰道B超可見孕囊者為臨床妊娠(宮內妊娠)。

5.觀察指標計算方法：dnE2增幅=(dn-d0)E2/d0E2×100%；獲卵率=所獲卵母細胞數/HCG注射日直徑≥14 mm的卵泡數×100%；正常受精率=正常受精數/成熟卵母細胞數×100%；優(yōu)胚率=2PN優(yōu)胚數/2PN數×100%。種植率=B超下見到的孕囊數/移植胚胎數×100%。

6.分組方法：根據取卵日相對于HCG日E2比值(d2E2/d0E2)的四分位數(P25，P75)分為A組(P75)；根據胚胎移植(ET)日相對于HCG日E2比值(d5E2/d0E2)的四分位數(P25，P75)分為D組(P75)。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、妊娠組與非妊娠組基本特征及促排卵情況

收集的41份病例中，臨床妊娠20例(48.8%)，非妊娠21例(51.2%)。兩組間年齡、體重指數(BMI)、基礎AFC數、基礎激素水平、移植胚胎數、獲卵數、正常受精數、優(yōu)胚數，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 妊娠組與非妊娠組基本特征及促排卵情況比較[(-±s)，M(P25，P75)]

二、妊娠組與非妊娠組自HCG日起連續(xù)6 d血清 E2濃度變化及變化幅度比較

妊娠組和非妊娠組HCG日的血清E2濃度分別為(13 688.95±4 851.43)pmol/L和(11 625.81±4 755.09)pmol/L；HCG日后1 d血清E2濃度上升至高峰，妊娠組達到(17 211.85±5 283.07)pmol/L，非妊娠組達到(14 848.29±5 799.09)pmol/L；OPU后1 d血清E2濃度降至最低，妊娠組和非妊娠組分別為(2 482.75±1 080.95)pmol/L 和(2 251.38±952.28)pmol/L；自OPU后第2天開始上升，至ET日妊娠組(6 626.60±2 401.13)pmol/L和非妊娠組(6 047.71±2 587.54)pmol/L，均低于HCG日。雖然各時點血清E2濃度妊娠組均比非妊娠組高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 兩組自HCG日起連續(xù)6 d血清E2濃度變化趨勢

兩組各時點血清E2變化幅度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。妊娠組在移植前1 d的E2水平下降幅度(66.73%)較非妊娠組(68.26%)少，提示移植前1 d血清E2較HCG日下降較少時可能會有較高的妊娠率。

三、按取卵日相對于HCG日E2比值四分位數分組分析

根據取卵日相對于HCG日E2比值(d2E2/d0E2)四分位數(P25，P75)分成A組(<0.44，n=10)、B組(0.44～0.68，n=21)和C組(>0.68，n=10)。三組間基本特征(年齡、BMI、不孕年限、AFC及基礎激素水平)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與A組和C組相比，B組的正常受精數顯著增高(P<0.05)，可用胚胎數略高但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與A組相比，B組的獲卵數顯著增高(P<0.05)；3組間正常受精率、優(yōu)胚率、胚胎種植率、妊娠率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。提示當0.44≤d2E2/d0E2≤0.68時，獲卵數及正常受精數較高，但不能提升臨床妊娠率(表3)。

表2 妊娠組與非妊娠組自HCG日至ET日血清E2濃度變化幅度比較[(-±s)，M(P25，P75)，%]

表3 按取卵日相對于HCG日E2比值四分位數分組分析[(-±s)，M(P25，P75)，%]

四、按ET日相對于HCG日E2比值四分位數分組分析

根據ET日相對于HCG日E2比值(d5E2/d0E2)四分位數(P25，P75)分成D組(<0.41，n=10)、E組(0.41～0.52，n=21)和F組(>0.52，n=10)。三組間基本特征(年齡、BMI、不孕年限、AFC及基礎激素水平)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；E組較其他兩組的正常受精率更高(69.68%)、優(yōu)胚率更低(25.27%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E組的妊娠率略高于D組和F組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示當0.41≤d5E2/d0E2≤0.52時，正常受精率較高，但不能顯著提高臨床妊娠率(表4)。

表4 按ET日相對于HCG日E2比值四分位數分組分析[(-±s)，M(P25，P75)，%]

討 論

雌激素在卵泡發(fā)育及內膜容受性方面發(fā)揮著重要作用，在COH過程中不可避免的會產生超生理量的血清E2濃度。血清E2濃度自HCG日至胚胎移植(ET)日如何變化及與妊娠結局的關系，目前國內外尚無統(tǒng)一觀點。本研究提示HCG日妊娠組和非妊娠組的血清E2濃度分別為(13 688.95±4 851.43)pmol/L和(11 625.81±4 755.09)pmol/L，自HCG日起連續(xù)6 d血清E2濃度均成曲線變化，在HCG日后1 d血清E2濃度上升至高峰，取卵(OPU)日后1 d血清E2濃度降至最低后又復升，各時點妊娠組的血清E2濃度均比非妊娠組高，但兩組間的血清E2濃度，血清E2濃度變化幅度、獲卵數、正常受精數、優(yōu)胚數差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2019年，Li等[1]的研究認為在鮮胚移植周期中，最佳的HCG日血清E2濃度范圍為3 670 pmol/L～11 553.16 pmol/L，而在本研究中，妊娠組HCG日血清E2濃度的均值高于此范圍。另有研究認為HCG日血清E2濃度并不能預測活產率[3]。注射HCG后34～36 h為OPU日，此時血清E2濃度為卵細胞成熟時體內所處的內環(huán)境，其變化水平間接反映體內卵細胞的發(fā)育情況。本研究發(fā)現妊娠組與非妊娠組在OPU日的血清E2濃度(d2E2)均值分別為(6 998.15±3 094.74)pmol/L和(6 781.90±2 754.92)pmol/L，分別較HCG日下降46.54%和38.91%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2016年，盧娜等[4]研究發(fā)現鮮胚移植周期中，OPU日較HCG日血清E2濃度升高的組別的臨床妊娠率、種植率及出生率均高于下降組及持平組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在子代安全方面三組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。本研究的41例患者中，只有1例患者的血清E2濃度在OPU日較HCG日上升約32.88%，其余均下降；將OPU日與HCG日血清E2濃度的比值(d2E2/d0E2)按四分位數分為3組后比較了組間妊娠率及促排卵后各個指標的差異，發(fā)現當0.44≤d2E2/d0E2≤0.68時，有較高的獲卵數與正常受精數，但不能提升妊娠率與種植率。OPU后隨著顆粒細胞的丟失，血清E2濃度降低，本研究發(fā)現d3(OPU后1 d)E2濃度降至最低點，然后逐漸上升，但妊娠組血清E2濃度在OPU后2 d較HCG日下降約66.73%，非妊娠組下降約68.26%。這與2015年張雅潔等[5]的研究相似，該研究認為在OPU后2 d血清E2較HCG日下降，隨著下降幅度的增加，卵裂期胚胎移植周期早期流產及異位妊娠的風險增加。在OPU后第3天即為ET日，在本研究中妊娠組與非妊娠組在ET日的血清E2濃度分別為(6 626.60±2 401.13)pmol/L和(6 047.71±2 587.54)pmol/L，這與2017年Rehmanm等[6]的研究結果相似，提示ET日較高的血清E2濃度可預示較好的妊娠結局。同時本研究將ET日血清E2濃度與HCG日血清E2濃度比值(d5E2/d0E2)按四分位數分為3組后，發(fā)現當0.41≤d5E2/d0E2≤0.52時，正常受精率較高，但并不能顯著提高臨床妊娠率(P>0.05)，而孫瑩璞等[7]研究認為當d5E2/d0E2<0.25時，臨床妊娠率顯著降低(P<0.01)，建議適當補充雌孕激素，提高臨床妊娠率。

正常育齡婦女在排卵后黃體中期會形成第2個E2高峰，有研究認為黃體期E2可刺激孕激素受體，促進子宮內膜腺體和子宮內膜上皮細胞肥大和增生，為胚胎植入做準備[8]。本研究的不足在于未對移植后黃體中期血清E2濃度與妊娠結局進行研究。2015年韋靜等[9]對ET后血清E2濃度進行了相關研究，分析了274個長方案IVF-ET周期，在HCG注射日、ET日、ET后4 d及ET后8 d監(jiān)測血清E2濃度，結果顯示，血清E2濃度在妊娠組與未妊娠組均呈下降趨勢，但妊娠組在各時點的血清E2濃度均高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ET后4 d較ET日血清E2濃度的下降幅度在兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但妊娠組在ET后8天血清E2濃度為(2 201.27±2 343.30)pmol/L，非妊娠組為(549.40±403.33)pmol/L，妊娠組的E2濃度下降幅度顯著小于非妊娠組(P<0.01)。2018年Florêncio等[10]評估了在黃體中期(ET后7 d)血清E2濃度與妊娠結局的關系，結果發(fā)現血清E2濃度在<367 pmol/L、367～1 835 pmol/L和>1 835 pmol/L三個不同濃度區(qū)間的妊娠率分別為13.3%、26.8%和36.3%，妊娠組的血清E2濃度在3 049.77～3 086.47 pmol/L之間，非妊娠組在1 445.98～1 592.78 pmol/L之間，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。然而，在黃體期添加雌激素后是否會改善妊娠結局，國內外相關研究的結論尚未統(tǒng)一。

理論上，黃體可以產生雌、孕激素，雌激素可能具有促進黃體血管形成、維持黃體形成因子與溶解因子之間的平衡、調節(jié)內膜孕激素受體表達影響孕激素發(fā)揮作用等功能[11]。在COH過程中，不同濃度的雌激素可不同程度地影響與子宮內膜容受性相關的部分蛋白質的表達，合適的雌激素濃度可能是保證高妊娠率的條件[12]。鮮胚移植周期促排卵時超生理量的E2水平，在取卵后又快速下降，低雌激素水平可延遲內膜成熟。因此，有學者提出添加雌激素進行黃體支持可進一步提高妊娠率[13]。針對不同卵巢反應的人群，有研究認為對于卵巢高反應[14]及正常反應的人群[15]添加雌激素后不能改善妊娠結局，對卵巢低反應的人群添加雌激素后是否有利于妊娠結局尚有爭議[13，16]。在運用不同方案的人群中，有研究認為黃體期加用雌激素的治療并不能改善妊娠結局，甚至有降低妊娠率的可能，而對于運用長方案治療的患者，由于其易導致血清E2濃度顯著降低，外源性雌激素的使用可能有一定效果[17]。2017年Pinheiro等[18]對2000～2016年的文獻進行了篩選，評估在拮抗劑方案的黃體期添加雌激素后是否會影響妊娠率，發(fā)現僅有一項研究認為補充雌激素后有利于胚胎著床，但不能提升妊娠率。近期的兩項薈萃分析也認為添加雌激素后并不能改善妊娠結局[19-20]。當對人黃體細胞進行體外培養(yǎng)時，加入不同濃度的雌激素后將不同程度地影響孕激素的產生，因此如果雌/孕激素的比例不合適，過量的雌激素可抑制孕激素的產生，影響子宮內膜的容受性，有研究者推測適量的雌激素是保證正常妊娠的必要條件之一[21]。2019年?akar等[15]研究認為在采取拮抗劑方案的ICSI周期中，補充4 mg的雌激素并不能改善妊娠結局；Ismail等[22]也得出了相似的結論。2015年Zhang等[23]研究發(fā)現添加6 mg/d的雌二醇者具有較高的妊娠率，但是Kutlusoy等[13]發(fā)現黃體酮+6 mg雌二醇組與單純黃體酮組的臨床妊娠率無顯著差異。因此目前國內外對黃體期是否添加雌激素，以及添加不同劑量的雌激素對妊娠結局的影響仍未達成一致，但是關于雌激素的劑型不會影響妊娠結局已在2019年Scheffer等[24]的研究中得到了證實。

綜上所述，在IVF-ET周期中自HCG日起至卵裂期胚胎移植日血清E2濃度成曲線變化，在HCG日后1天上升至高峰，取卵后1天下降至最低后又復升，各時點妊娠組E2濃度均比非妊娠組高；當0.44≤d2E2/d0E2≤0.68時有更多的獲卵數及正常受精數，但不能改善臨床妊娠率；當0.41≤d5E2/d0E2≤0.52時會有較高的正常受精率，但優(yōu)胚率低，也不能顯著提高臨床妊娠率。由于本研究樣本量偏少，因此今后將擴大樣本量，繼續(xù)連續(xù)測定血清E2濃度至黃體中期以綜合評估血清E2濃度的變化與妊娠結局的關聯性，為今后黃體支持中是否需要添加雌激素提供理論支持。