Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠和大鼠模型述評

陶 寧,張 杰

(1中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院中醫(yī)科,沈陽 110001;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科;*通訊作者,E-mail:zhangjie945@126.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜長期慢性炎癥為基本病理改變的系統(tǒng)性多關(guān)節(jié)炎,其臨床多表現(xiàn)為對稱性、侵襲性小關(guān)節(jié)炎癥,可累及到關(guān)節(jié)外器官,導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直,但發(fā)病機(jī)制尚不明確。為深入研究RA的發(fā)病機(jī)制、病理變化、藥物篩選以及免疫治療等方面,選擇合適的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型尤為重要。Ⅱ膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型是以慢性、多發(fā)性末端關(guān)節(jié)炎,甚至關(guān)節(jié)損傷等表現(xiàn)為主的免疫性炎癥模型,其臨床表現(xiàn)和病理改變等方面與RA有諸多相似之處,是研究RA的金標(biāo)準(zhǔn)模型[1]。

Trentham等[2]1977年首次報(bào)道了CIA模型,該模型的發(fā)病機(jī)制包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面。在體液免疫中,異種動(dòng)物Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen,CⅡ)注入動(dòng)物體內(nèi)后,活化B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性膠原蛋白抗體在關(guān)節(jié)部位與膠原蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物活化了補(bǔ)體系統(tǒng)從而產(chǎn)生免疫反應(yīng),其中Th1型細(xì)胞因子通過增加MHC-Ⅱ和黏附分子的表達(dá),促進(jìn)抗原遞呈活化巨噬細(xì)胞,在CIA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3-5]。然而,并非所有產(chǎn)生抗Ⅱ型膠原抗體的動(dòng)物都出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎,抗體滴度與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度也并非成正比,這說明單一的體液免疫并不能完美詮釋CIA的發(fā)病原因,需結(jié)合細(xì)胞免疫進(jìn)行綜合分析。在細(xì)胞免疫中,T細(xì)胞上的CD4分子和T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別與抗原片段結(jié)合的MHC分子,分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)該抗原的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),提示T細(xì)胞反應(yīng)在CIA的發(fā)病中起重要作用,這與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者免疫學(xué)改變相似[6-8]。

目前,無論是在RA的免疫研究、新藥研發(fā)與篩選還是療效評價(jià)等方面,CIA模型都是最理想的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[9,10]。本文闡述了影響該模型成功建立和成模率的主要因素以及需注意的問題。

1 鼠種的選擇

目前,國內(nèi)外CIA造模采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為大鼠或小鼠,其優(yōu)點(diǎn)在于高度的遺傳背景同質(zhì)性、低成本和易處理。在CIA的致病能力方面,二者及其各自種系間又存在差異。不同種系小鼠對CIA的敏感度不同[7],這是因?yàn)門h1型細(xì)胞因子通過增加MHC-Ⅱ和黏附分子的表達(dá)來影響CIA的發(fā)生發(fā)展[11],CIA動(dòng)物的敏感性也與其特定基因MHC-Ⅱ的表達(dá)息息相關(guān)[12,13]。研究表明,MHC表現(xiàn)為H-2r、H-2q的單倍型小鼠對CIA易感性最強(qiáng),如DBA/1(H-2q)、B10.RⅢ(H-2r)小鼠;而MHC表現(xiàn)H-2b、H-2d的小鼠,對關(guān)節(jié)炎膠原誘導(dǎo)具有相對抵抗性,屬于易感性較差的品系,如C57BL/6(H-2b)、BALB/c(H-2d)小鼠[12,14,15],亦可在膠原蛋白誘導(dǎo)下發(fā)生關(guān)節(jié)炎。因此,近交系DBA/1、C57BL/6J、BALB/c是目前國際認(rèn)可的CIA模型小鼠。

DBA/1小鼠作為CIA經(jīng)典模型鼠,其關(guān)節(jié)炎程度較重,出現(xiàn)滑膜炎、軟骨和骨侵蝕等類似于人RA的病理變化,成模率高達(dá)90%-100%,且關(guān)節(jié)炎癥狀表現(xiàn)及嚴(yán)重程度差異性小[15,16],盡管存在價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)條件要求高、臨床表現(xiàn)持續(xù)時(shí)間較短等缺點(diǎn),但DBA/1小鼠仍是CIA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的佳選;C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)小鼠,均屬于不易感品系,其中C57BL/6品系對雞Ⅱ型膠原可產(chǎn)生強(qiáng)烈且持續(xù)的T細(xì)胞反應(yīng)而引發(fā)關(guān)節(jié)炎,常規(guī)造模方法成模率可達(dá)50%-70%,但有文獻(xiàn)指出改進(jìn)免疫方法即基礎(chǔ)免疫后第21天在其后足(替代尾根部)注射膠原乳劑,其成模率可提高到100%。C57BL/6(H-2b)小鼠的優(yōu)點(diǎn)在于其炎癥持續(xù)時(shí)間較DBA/1小鼠更長,且大多數(shù)轉(zhuǎn)基因和基因敲除的小鼠都是在其背景上實(shí)踐的,更適合作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生機(jī)制研究和藥物開發(fā)的動(dòng)物模型[17,18]。不足之處在于C57BL/6鼠種關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)僅在后足,腫脹程度差異性較大,且性情暴躁,易造成動(dòng)物死亡和實(shí)驗(yàn)人員受傷,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。BALB/c鼠作為CIA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究較少,有文獻(xiàn)指出該鼠造模具有重現(xiàn)性好、周期短、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、成模率較高等優(yōu)點(diǎn)[19],但實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少,其準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步證實(shí)。

大鼠受MHC基因類型的影響較小,具有較廣的種系范圍,如遠(yuǎn)交系DA大鼠、SD和Wistar大鼠、近交系Lewis大鼠等。其中遠(yuǎn)交群SD和Wistar大鼠因其適應(yīng)力強(qiáng),繁殖快,足爪紅腫明顯,關(guān)節(jié)畸形,軟骨表面較明顯破壞,慢性病程,治療耗時(shí)長(連續(xù)觀察21周)等與RA相似的特點(diǎn)被國內(nèi)高頻率應(yīng)用[8,20],但大鼠的實(shí)際成模率不如小鼠,始終未達(dá)到100%成模。

2 鼠齡的選擇

據(jù)統(tǒng)計(jì),在人類RA患者中,40-65歲為高發(fā)年齡段,提示年齡在RA的發(fā)生發(fā)展過程中的影響存在差異。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,小鼠應(yīng)至少7-8周齡才易被誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎,因?yàn)榇藭r(shí)的小鼠才具有成熟免疫系統(tǒng)[21]。以常用的高敏感性DBA/1小鼠為例,要達(dá)到90%-100%的高成模率,一般選6-8周齡;低敏感性的以C57BL/6小鼠為例,其在12-14周齡會(huì)有50%-60%較高成模率[22,23]。老年小鼠亦可用于造模,但其發(fā)病率和嚴(yán)重程度均不佳。在大鼠方面,幼年大鼠明顯較老年大鼠更容易誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。以常用的Wistar大鼠和SD大鼠為例,研究表明4-5周齡Wistar大鼠建模成功率達(dá)83.3%[8],6周齡Wistar大鼠CIA造模成功率可達(dá)92%[24]。4周齡SD大鼠成模率可達(dá)90%[20],5-6周齡SD大鼠的成模率約為75%[25]。由此可見,鼠齡對CIA模型的成模率有重要影響。

3 性別的選擇

在臨床中,女性RA患病率約為男性患者的4倍[26]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,雌性大鼠較雄性更容易誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[8],這一點(diǎn)也與人體RA的男女患病比率相似;而在小鼠中,最新文獻(xiàn)[27,28]提示雄性小鼠具有較高的膠原蛋白性關(guān)節(jié)炎易感性,其發(fā)病率和嚴(yán)重程度均高于雌性小鼠,高應(yīng)答品系DBA/1、B10.RⅢ雄性小鼠的CIA成模率可達(dá)90%-100%,分析其原因可能有以下兩方面:一是高濃度的雌激素可抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),雌激素的代謝產(chǎn)物亦可降低滑膜組織的炎性程度[29],提示雌性鼠CIA成模率較低可能與其體內(nèi)較多的雌激素有抑制關(guān)節(jié)炎的作用有關(guān);二是雄鼠之間的互相攻擊會(huì)增加其對CIA的易感性,并且對嚴(yán)重的自發(fā)性肌腱附著點(diǎn)病變的發(fā)展具有促進(jìn)作用[30]。但雄鼠間過度打斗的致傷、致殘、致死會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)避免此類情況發(fā)生。以上均說明性別差異會(huì)影響造模成功率。此外,另有研究表明低應(yīng)答品系C57BL/6小鼠應(yīng)用于CIA造模時(shí)雌雄小鼠的發(fā)病率和嚴(yán)發(fā)重程度差異不明顯,其中雌性小鼠占46%,雄性小鼠占54%,提示該鼠性別的差異對于CIA模型成模率的影響較小,可忽略不計(jì)[23]。

4 CⅡ來源及濃度的選擇

不同來源的CⅡ會(huì)造成鼠對其免疫應(yīng)答及關(guān)節(jié)炎發(fā)展方面的差異。對于小鼠而言,即使易感性高的DBA/1和B10.RⅢ小鼠用同源性的Ⅱ型膠原免疫,其CIA發(fā)病率仍然非常低(約10%)[31]。而對于大鼠,自體大鼠CⅡ可用來免疫大鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型[2]。因此,誘導(dǎo)大鼠的CIA,選同源或異源性Ⅱ型膠原均可;而誘導(dǎo)小鼠的CIA,則僅可選用異源性CⅡ(如牛、雞、豬源)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[32-34]。一般說來,豬源性CⅡ中最易誘發(fā)關(guān)節(jié)炎,其次是牛源性CⅡ,雞源性CⅡ致炎效果最差[35]。然而,不同品系小鼠對來源性CⅡ的敏感度存在差異,如DBA/1小鼠對雞、牛、豬和人源性CⅡ都具有高敏感性,大鼠與DBA/1小鼠相似,對人源性CⅡ敏感度稍差;B10.RⅢ小鼠對牛和豬源性CⅡ有強(qiáng)反應(yīng),但對雞型和人源性CⅡ的反應(yīng)較差[15,35];而易感性差的C57BL/6小鼠對雞源性CⅡ有強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[17]。在CIA造模實(shí)驗(yàn)中,高成模率的DBA/1小鼠通常選擇雞或牛源性CⅡ,具有CIA抗性的C57BL/6小鼠則選雞源性CⅡ,這兩種CⅡ在大鼠造模中均被高頻率應(yīng)用。

除了CⅡ的來源不同會(huì)影響鼠成模率,CⅡ的濃度也是影響鼠CIA高成模率的關(guān)鍵。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),采用同種CⅡ造模,其發(fā)病率也會(huì)因其濃度的不同而異,高濃度CⅡ免疫的大鼠發(fā)病率更高[27]。因此,只有CⅡ達(dá)到一定濃度時(shí),才能誘導(dǎo)T細(xì)胞,激發(fā)其對自身CⅡ的免疫反應(yīng)而誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。相關(guān)文獻(xiàn)[16,22]提示高應(yīng)答品系小鼠的成模率高達(dá)90%-100%,注射膠原的濃度為2 mg/ml;低應(yīng)答品系小鼠的成模率為50%-70%,注射膠原的濃度為2.5 mg/ml。但需注意的是當(dāng)CⅡ濃度過大時(shí),可能會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)部位嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),影響實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。因此在配制乳劑時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適濃度的CⅡ。

5 佐劑的種類與濃度的選擇

佐劑分為弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)和弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)兩種,佐劑的選擇及其濃度的大小直接影響著CIA的發(fā)病率。兩種佐劑均為淡黃色透明溶液,二者區(qū)別的關(guān)鍵在于CFA含有結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分,該成分能有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體,加強(qiáng)對抗原的抗體反應(yīng)。補(bǔ)體的激活須有抗原抗體復(fù)合物的參與,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的重要步驟正是激活補(bǔ)體系統(tǒng);而IFA只含有礦物油成分,僅可協(xié)助抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體應(yīng)答,一般用于加強(qiáng)免疫[36]。因此CFA與CⅡ乳化后免疫的小鼠能更迅速地誘發(fā)為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)病變,如滑膜增生、單核細(xì)胞浸潤、軟骨降解等[37,38]。小鼠第0天進(jìn)行首次免疫應(yīng)選擇CⅡ與CFA充分乳化,第21天進(jìn)行加強(qiáng)免疫時(shí)則可根據(jù)小鼠的狀態(tài)選擇CⅡ與CFA或IFA乳化,大鼠免疫所選擇的佐劑與小鼠相同[39,40]。兩次免疫均用CFA時(shí),小鼠可能會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),考慮小鼠品系及發(fā)病率的問題,敏感性高的小鼠加強(qiáng)免疫一般可采用IFA加強(qiáng)免疫,敏感性低的小鼠則考慮繼續(xù)采用等劑量CFA。

確定兩次免疫所需的佐劑之后,其次確定的就是佐劑的濃度。低應(yīng)答小鼠品系以C57BL/6為例,常規(guī)免疫方法要達(dá)到60%左右的高發(fā)病率時(shí),每只鼠注射的膠原乳劑中CFA的濃度為5 mg/ml[14-18];對于高應(yīng)答品系,如DBA/1小鼠,發(fā)病率要達(dá)到90%-100%時(shí),每只鼠注射的混合乳劑中CFA的濃度為4 mg/ml[21,22]。值得注意的是佐劑濃度偏高時(shí)可能導(dǎo)致注射部位潰爛,甚至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

6 實(shí)驗(yàn)操作過程

準(zhǔn)確而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)過程及操作是CIA模型成功建立和高成模率的基礎(chǔ)。以小鼠為例,在無菌避光條件下,將CⅡ(雞或牛)粉末溶解于0.02 mol/L冰醋酸溶液中,使其形成終濃度為2 mg/ml的溶液,研磨攪拌均勻置于4 ℃冰箱過夜,第2天在相同條件下,將CⅡ溶液與等體積的濃度為4 mg/ml的CFA溶液在冰上充分混合乳化形成白色乳劑。第0天每只小鼠于靠近尾根部約1-2 cm處兩點(diǎn)或多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.15 ml乳劑進(jìn)行初次免疫,第21天以同樣的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫,每只小鼠注射0.1 ml,該乳劑-80 ℃可保存1周,若二次免疫后CIA模型未成,可繼用本次配好的乳劑再補(bǔ)一次免疫[21,32]。大鼠的操作過程與小鼠大致相同,需根據(jù)大鼠的體重調(diào)整注射劑量。在造模操作過程中,還有以下三點(diǎn)需要特殊注意。

6.1 Ⅱ型膠原的保存

除了選擇適合的Ⅱ型膠原蛋白,正確的保存方法也是CIA高成模率的關(guān)鍵。文獻(xiàn)指出CⅡ是一種無色透明的溶液,應(yīng)置于-4 ℃黑暗的條件下短期保存,保存時(shí)間為2個(gè)月以上者,應(yīng)避光保存于-20 ℃冰箱中[22,41]。液體若出現(xiàn)渾濁,則表明它可能已經(jīng)交聯(lián)沉淀,或者受到污染,變性的CⅡ?qū)㈦y以形成乳劑而致小鼠、大鼠CIA不成?；虺赡Ｂ蕵O低。建議將膠原蛋白溶液以小等份試樣的方式儲(chǔ)存,以便解凍所需的實(shí)驗(yàn)量,變性的膠原應(yīng)棄之勿用。

6.2 乳化的條件

乳化的是否充分直接影響CIA造模的成功率。首先,保持CⅡ的抗原特性是至關(guān)重要的一步。酸性溶液中的凍干膠原蛋白和膠原蛋白溶液在-20 ℃下黑暗中穩(wěn)定,新配制的膠原蛋白溶液可以在4 ℃保持一周,但之后應(yīng)密封保存在-20 ℃。其次,選用乳化的方法也尤為重要。通常有以下3種:①研磨法是將等體積抗原與佐劑分別研磨后加入冰浴研缽中不斷研磨,直至溶液成白色乳滴狀。此法適用于大批量乳劑的制備,雖然乳化比較完全,DBA/1小鼠成模率可達(dá)100%[42,43],但形成黏稠的乳化物會(huì)大量地附著在研缽壁上,乳劑回收率較低,且乳化時(shí)間需要2 h左右,耗時(shí)耗力。此外,根據(jù)個(gè)人造模經(jīng)驗(yàn),在單獨(dú)研磨膠原溶液時(shí),由于室內(nèi)濕度溫度的影響可能出現(xiàn)膠原內(nèi)液體蒸發(fā)現(xiàn)象而導(dǎo)致乳劑制備失敗。②注射器混合法利用橡皮管將兩個(gè)5 ml注射器連接在一起作為乳化的工具,將抗原和佐劑在冰浴環(huán)境中進(jìn)行互推,反復(fù)抽吸,直至形成白色乳劑[15]。此法適用于小劑量乳劑的制備,雖然避免了研磨法可能出現(xiàn)抗原液體蒸發(fā)的情況,也解決了乳劑回收問題,但乳化過程耗時(shí)費(fèi)力,且難以乳化完全又不穩(wěn)定。③超聲勻漿法操作簡便快捷,但產(chǎn)熱較大,且超聲會(huì)將膠原分成多個(gè)片段,而小片段膠原在正常體溫下易變性,結(jié)果較不理[33,38]。

據(jù)文獻(xiàn)提示,電動(dòng)攪拌器被強(qiáng)烈推薦用于膠原乳劑的制備[41]。中山大學(xué)黃小榮等[44]的實(shí)驗(yàn)室在電動(dòng)攪拌器的基礎(chǔ)上進(jìn)行整合改進(jìn),研究出了一種省時(shí)省力又避免膠原浪費(fèi)的膠原乳化的方法,即電動(dòng)佐劑攪拌器與注射器結(jié)合法。將抗原和弗氏佐劑加入30 ml針筒中,再用電動(dòng)佐劑攪拌棒進(jìn)行混合乳化。該法不但有效地規(guī)避了以上幾種方法的弊端,而且效率高,便于操作、清洗和消毒,乳劑可充分乳化且回收率高,值得借鑒學(xué)習(xí)。

6.3 注射部位及方法

大量文獻(xiàn)[8,12,14,16,22,39,45]提示,CIA造模選取注射的部位為鼠的尾根部。背部注射也能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎,但需要更多膠原乳劑;腹腔注射乳劑時(shí),胸膜和腹膜會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),因此不建議采用這兩種注射部位[46]。鼠的毛比較茂密,為了方便操作,注射前須剃掉尾根部周圍的毛,勿損傷小鼠皮膚。乳劑應(yīng)保證注射到皮膚內(nèi)淺表部位,并維持在小鼠尾根部皮內(nèi)區(qū)域,不應(yīng)在其體內(nèi)移動(dòng),注意避免刺入尾根部附近的臟器組織。注射的位置不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致尾根部皮膚潰爛嚴(yán)重甚至脫落且成模率低,若不慎將乳液注入尾靜脈,則會(huì)導(dǎo)致小鼠迅速死亡[41]。

目前,CIA造模常用注射方式有兩種,即皮下注射和皮內(nèi)注射[47-49]。皮下注射是指將乳劑注射到皮下組織,即淺筋膜,位于皮膚與深筋膜之間,由疏松結(jié)締組織和脂肪組織構(gòu)成。該方法雖操作和進(jìn)針較容易,可注射較多液體,但不能精確地定位藥物作用的部位且吸收快;皮內(nèi)注射是指將乳劑注射到表皮和真皮之間,真皮為含有大量纖維成分的致密結(jié)締組織。本法操作和進(jìn)針較皮下注射困難且藥物的注射量較少,但乳劑可主要集中于注射部位,定位較準(zhǔn)確,并且吸收速度較慢,可以對機(jī)體產(chǎn)生較為長久的刺激,促使機(jī)體對刺激產(chǎn)生反應(yīng)。綜上,兩種方法雖然均有利弊,但結(jié)合文獻(xiàn)及CIA造模的成功率,皮內(nèi)注射為最佳選擇。

7 結(jié)語

目前,國內(nèi)外已探究多種動(dòng)物模型用于RA病因以及發(fā)病機(jī)制的研究,包括佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎、鏈球菌細(xì)胞壁(SCW)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎、K/BxN小鼠模型等。與之相比,CIA雖制備方法較古老,但以其高度可重復(fù)性以及可操作性的優(yōu)勢,仍是RA臨床和基礎(chǔ)研究中最經(jīng)典、最理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,為RA尋找新的治療靶點(diǎn)及新藥的驗(yàn)證,更好地轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用,提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。本述評為了各實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行高效且成功的CIA小鼠和大鼠造模實(shí)驗(yàn),詳細(xì)地評述了該模型在建模過程中材料的選擇以及操作過程,將實(shí)驗(yàn)中的細(xì)節(jié)進(jìn)行量化、規(guī)范化,避免實(shí)際操作中因失誤所導(dǎo)致的造模失敗,以期對相關(guān)領(lǐng)域研究者的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供借鑒。