浙江省甜瓜根、葉部鐮孢菌種類的分離與鑒定

郝芳敏 嚴(yán)蕾艷 臧全宇 馬二磊 丁偉紅 黃蕓萍 王毓洪

摘 ? ?要：從寧波和臺(tái)州的不同地區(qū)采集了具有發(fā)病癥狀的甜瓜根部和葉部樣品，采用常規(guī)的組織分離法進(jìn)行分離純化，共獲得32株鐮孢菌，經(jīng)過分子鑒定，利用ITS和TEF-1α序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分別包含11個(gè)尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、11個(gè)腐皮鐮孢菌（F. solani）、4個(gè)厚垣鐮孢菌（F. chlamydosporum）、4個(gè)共享鐮孢菌（F. commune）和1個(gè)層生鐮孢菌（F. proliferatum），其中尖孢鐮孢菌占鐮孢菌總量的34.38%，對(duì)其中1株尖孢鐮孢菌菌株TG5進(jìn)行致病力測(cè)定，認(rèn)為其可以造成甜瓜的枯萎癥狀，該結(jié)果為明確浙江省的鐮孢菌種類奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜;鐮孢菌;分離純化;分子鑒定

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2020）11-013-05

Abstract： To identify the Fusarium species of Cucumis melo L. crops in Zhejiang province， symptomatic roots and leaves of the samples were collected from different areas in Ningbo and Taizhou. The Fusarium strains were isolated and purificated by the conventional tissue method. The total 32 isolates were isolated from the roots and leaves of the samples. Based on the sequences of ITS and TEF-1α， two phylogenetic trees were established， which were identified as 5 species of Fusarium， 11 isolates of Fusarium oxysporum， 11 isolates of F. solani， 4 isolates of F. chlamydosporum， 4 isolates of F. commune， 1 isolates of F. proliferatum， respectively. The species of F. oxysporum accounting for 34.38%. The pathogenicity of one strain TG5 of F. oxysporum was determined， which could cause the wilt symptoms of melon.

Key words：Cucumis melo L.; Fusarium; Isolation and purificated; Molecular identification

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫蘆科一年生蔓生草本植物，又名哈密瓜、甘瓜、香瓜等，食用價(jià)值高，廣受消費(fèi)者喜愛，是世界十大水果之一[1-2]。西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)是浙江省十大農(nóng)業(yè)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，也是浙江省重要的經(jīng)濟(jì)作物，在浙江省的蔬菜瓜果產(chǎn)業(yè)中占有重要地位[3]。

但是，甜瓜病害一直是生產(chǎn)上的難題，尤其是甜瓜枯萎病。甜瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌甜瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. melonis）引起的一種真菌病害，是一種世界類土傳維管束病害。甜瓜枯萎病又稱為蔓割病、死秧、萎蔫病、疫病、死藤等，在甜瓜全生育期均可發(fā)生，其中，甜瓜開花期至坐果期是發(fā)病的高峰期，發(fā)病率在50%～70%[4]。甜瓜枯萎病常常造成植株的主根顏色變褐并出現(xiàn)腐爛的癥狀，空氣濕度大時(shí)，根部甚至?xí)霈F(xiàn)粉紅色或者白色的霉?fàn)钗?，田間一旦發(fā)現(xiàn)病株，病害會(huì)很快在田間蔓延，對(duì)甜瓜產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，其他鐮孢菌屬真菌也可引起甜瓜萎蔫及果實(shí)腐爛等癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。例如腐皮鐮孢菌（F. solani）可引起甜瓜根腐病[7];層生鐮孢菌（F. proliferatum）和木賊鐮孢菌（F. equiseli）可引起甜瓜根莖腐爛[8];磚紅鐮孢菌（F. lateritium）[9]、變紅鐮孢菌（F. incarnatum）[10]、木賊鐮孢菌（F. equiseti）[11]均可引起甜瓜果腐病。此外，鐮孢菌屬真菌可以通過種子傳播，也可在土壤中存活多年[12]，對(duì)甜瓜品質(zhì)造成嚴(yán)重?fù)p害。

筆者從浙江省寧波和臺(tái)州兩地發(fā)病的甜瓜根部和葉部采集了38個(gè)病樣進(jìn)行分離，獲得了32個(gè)鐮孢菌分離物，根據(jù)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）和轉(zhuǎn)錄延伸因子（TEF-1α）的序列鑒定，以期進(jìn)一步了解甜瓜根部鐮孢菌的種類，為防控鐮孢菌對(duì)甜瓜的危害提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

CTAB：CTAB 20 g，NaCl 81.82 g，1 mol·L-1 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mL，0.5 mol·L-1 EDTA （pH 8.0） 40 mL，加蒸餾水定容為l L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 采樣和病原菌分離

2019年在浙江省寧波市、臺(tái)州市甜瓜種植區(qū)采集甜瓜病根、病葉，在實(shí)驗(yàn)室對(duì)感病組織進(jìn)行病原菌分離，方法為：將甜瓜病根、病葉切成小塊，浸入1%次氯酸鈉溶液中3 min，取出浸入75%酒精1 min，再使用無(wú)菌水沖洗3遍，吸干水分后，轉(zhuǎn)移到含鏈霉素PDA培養(yǎng)基（培養(yǎng)基鏈霉素質(zhì)量濃度為100 μg·L-1）上，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出真菌菌落后，用平板稀釋法進(jìn)行單孢分離，將分離的真菌分別進(jìn)行純化、保存。

1.3 DNA序列擴(kuò)增及種特異性檢測(cè)

DNA提取：采用CTAB裂解法提取菌株的DNA[13]。采用50 μL的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）和翻譯延伸因子-1α（Translation Elongation Factor 1α，TEF -1α）的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增ITS的引物ITS1/ITS4（ITS1序列：5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?，ITS4序列：5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?），TEF-1α的引物EF1/EF4（EF1序列：5?-ATGGGTAAGGA（A/G）GACAAGAC-3?，EF2序列：5?-GGA（G/A）GTACCAGT（G/C）ATCATGTT-3?）。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，對(duì)純化陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序[14]。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測(cè)序獲得的ITS序列和TEF-1α序列在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行核酸序列比對(duì)，所有真菌的ITS序列和TEF-1α序列利用MEGA 7[15]軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，獲得所對(duì)應(yīng)的菌株分類地位。

1.5 致病力測(cè)定

病原菌孢子懸浮液的培養(yǎng)：將TG5菌株在PDA平板上培養(yǎng)3 d，用6 mm的打孔器在新鮮的菌絲邊緣打孔，將15個(gè)6 mm大小的菌絲塊，置于在200 mL的PDB培養(yǎng)基搖培40 h，補(bǔ)充轉(zhuǎn)速和溫度，兩層擦鏡紙過濾，孢子液稀釋至4×106個(gè)·mL-1[16-17]。

接種：在甜瓜幼苗2葉1心時(shí)，以50株幼苗為1組，3次重復(fù)，一半接種，一半不接種。接種的將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗從穴盤中取出，輕度損傷根系，洗凈根部，在準(zhǔn)備好的孢子液中浸根15 min，保持根系全部浸入，中間搖動(dòng)2次，防止孢子沉降;不接種的在清水中浸根15 min。浸根接種后，幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土中。接種后前3 d保持遮陰，溫度保持在25 ℃，3 d緩苗后撤掉遮陽(yáng)網(wǎng)，剔除不正常的苗子，之后在溫室正常管理，10 d后調(diào)查枯萎病發(fā)病情況[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS序列進(jìn)行的分子鑒定

用ITS和TEF-1α引物擴(kuò)增，將獲得的片段純化、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，共獲得32個(gè)鐮孢菌屬真菌（表1）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，菌株NG312、NG313、NG306、TY1、TY3、TY4、TY5、TY6、TY8、TG5、TG6與F. oxysporum聚為一簇，屬于尖孢鐮孢菌（F. oxysporum），NG312、NG313和NG306分離于臺(tái)州，其余8個(gè)菌株分離于寧波地區(qū);菌株NG324、NG300、NG13-2、NG20、NG3、NG29-2、NG12-2、NG2、NG7和NG305與F. solani聚為一類，認(rèn)為這11個(gè)菌株屬于腐皮鐮孢菌（F. solani），均分離于寧波地區(qū);菌株NG228、NG155、NG224和TY2與F. commune聚為一支，認(rèn)為這4個(gè)菌株屬于共享鐮孢菌（F. commune）;菌株NG304、NG8、NG18-1和TG4與F. chlamydosporum聚為一簇，認(rèn)為這4個(gè)菌株為厚垣鐮孢菌（F. chlamydosporum）;僅1個(gè)菌株NG227與F. proliferatum的菌株聚在一類，認(rèn)為NG227屬于層生鐮孢菌（F. proliferatum）（圖1）。

2.2 基于TEF-1α序列進(jìn)行的分子鑒定

對(duì)其中的一些菌株進(jìn)行基于TEF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，驗(yàn)證了這些菌株的分類地位（圖2），例如NG312與F. oxysporum聚為一簇;NG305、NG14、NG324、NG300、NG13-2、NG20、NG3、NG29-2、NG7與F. solani聚為一類;NG228、NG155與F. commune聚為一支;與基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹相一致。

2.3 致病力的測(cè)定

此外，對(duì)尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）TG5進(jìn)行致病力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)可以造成甜瓜植株的枯萎等癥狀（圖3），認(rèn)為TG5是尖孢鐮孢菌甜瓜?；停‵. oxysporum f. sp. melonis），其他菌株的致病力需要進(jìn)一步的測(cè)定。

3 討 論

尖孢鐮孢菌甜瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. melonis）是引起甜瓜枯萎病的一種真菌病害。為了解和明確甜瓜根部和葉部的鐮孢菌群體，筆者從發(fā)病的甜瓜根部和葉部進(jìn)行鐮孢菌的分離，共獲得了32個(gè)鐮孢菌分離物，其中包括11個(gè)尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、12個(gè)腐皮鐮孢菌（F. solani）、4個(gè)厚垣鐮孢菌（F. chlamydosporum），4個(gè)共享鐮孢菌（F. commune）和1個(gè)生鐮孢菌（F. proliferatum）等5個(gè)種，對(duì)其中的尖孢鐮孢菌TG5進(jìn)行致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)TG5是具有致病力（圖3），可引起甜瓜枯萎等癥狀。鑒定的4個(gè)共享鐮孢菌（F. commune）目前尚未在甜瓜病害中發(fā)現(xiàn)，但其致病力仍需進(jìn)一步明確，其他的鐮孢菌對(duì)甜瓜是否有致病性也需要進(jìn)一步研究。之前有對(duì)山西省瓜類作物根莖部上鐮孢菌種類的研究，共獲得353株鐮孢菌菌株，包括尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）、芬芳鐮孢菌（F. redolens）、腐皮鐮孢菌（F. solani）、輪枝鐮孢菌（F. verticillioides）、層生鐮孢菌（F. proliferatum）、禾谷鐮孢菌（F. graminearum）、半裸鐮孢菌（F. semitectum）和銳頂鐮孢菌（F. acuminatum）8個(gè)種，但未明確其致病性[19];此外馬國(guó)蘋研究甜瓜種子攜帶的鐮孢菌種類，從甜瓜種子上分離獲得了4個(gè)尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）、5個(gè)層生鐮孢菌（F. proliferatum）、5個(gè)木賊鐮孢菌（F. equiseti）和9個(gè)輪枝鐮孢菌（F. verticillioides），均對(duì)甜瓜的幼苗有致病性[20]。

本研究結(jié)果明確了浙江寧波、臺(tái)州地區(qū)甜瓜根部和葉部鐮孢菌群的種類，為更好地防治鐮孢菌對(duì)甜瓜造成的危害提供了一定的基礎(chǔ)。

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