李芳

摘要：提取在北京市房山地區(qū)野外環(huán)境中采集的1株野生菌子實(shí)體的基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行ITS、LSU和SSU片段的擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從菌絲體基因組DNA中擴(kuò)增獲得了700 bp左右的ITS片段、850 bp左右的LSU片段和1 800 bp左右的SSU片段，經(jīng)序列測(cè)定及比對(duì)，表明該真菌是Marasmiellus屬菌株。建立了一種野生真菌快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。

關(guān)鍵詞：皮傘屬；分子鑒定；ITS；LSU；SSU

中圖分類號(hào)： S646.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0024-02

我國地域廣闊，野生食用菌資源豐富、種類繁多、分布廣泛、蘊(yùn)藏量大。野生食用菌分類鑒定是涉及資源保護(hù)利用及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一項(xiàng)基礎(chǔ)性研究工作[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，從分子的層面上對(duì)野生菌進(jìn)行快速、有效的鑒定，為野生菌的鑒定、開發(fā)及利用提供了很大的便利[2]。本研究對(duì)北京市房山地區(qū)采集的1株野生菌進(jìn)行分子鑒定，并通過多個(gè)核基因序列的測(cè)定及比對(duì)分析，從而對(duì)該野生菌株的遺傳地位進(jìn)行解析，為該野生菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 子實(shí)體，采集自北京市房山區(qū)東湖港風(fēng)景區(qū)的野生菌。

1.1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒Dneasy Plant Mini Kit和凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購自德國QIAgen公司；TaKaRa PCR Mix購自大連寶生物公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司。

1.1.3 儀器 PCR儀（BIO-RAD，mycycler）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、離心機(jī)（Eppendorf 5418）、移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取少量子實(shí)體于1.5 mL離心管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末狀后，利用Dneasy Plant mini Kit試劑盒（QIAgen，貨號(hào)：69104）說明書進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2 ITS-PCR擴(kuò)增 選取ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物[3]，以所提基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；降至4 ℃結(jié)束。反應(yīng)體系為50 μL。然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 LSU-PCR擴(kuò)增

選取LR5（5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）和LROR（5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）為引物，以所提基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；降至4 ℃結(jié)束。反應(yīng)體系為 50 μL。然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 SSU-PCR擴(kuò)增

選取NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）和NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）為引物，以所提基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；降至4 ℃結(jié)束。反應(yīng)體系為50 μL。然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司利用PCR擴(kuò)增引物為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過DNAMAN5.2.9和Chromas Pro軟件進(jìn)行堿基修正與拼接，最終獲得的ITS、LSU和SSU序列提交到GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），并與數(shù)據(jù)庫中已知的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以所獲得的基因組DNA為模板，以材料與方法中所列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，所得ITS產(chǎn)物片段大小為700 bp左右，LSU產(chǎn)物片段大小為850 bp左右，SSU產(chǎn)物片段大小為1 800 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相一致。

2.2 序列測(cè)定及提交

上述3個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，電泳條帶經(jīng)過QIAquick Gel Extraction Kit回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過Chromas Pro軟件進(jìn)行堿基修正，修正后的正向引物的測(cè)序結(jié)果和反向引物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過DNAMAN5.2.9軟件進(jìn)行拼接，最終獲得ITS序列 634 bp，LSU序列834 bp和SSU序列1 758 bp。將上述序列提交至GenBank，獲得GenBank登錄號(hào)分別為：KJ545432、KJ545433和KJ545434。

2.3 BLASTN比對(duì)分析

在NCBI網(wǎng)站上用BLASTN程序進(jìn)行比對(duì)。ITS序列（GenBank登錄號(hào)KJ545432）的比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與Uncultured root-associated fungus clone SC0IIc23P（FJ362110）、Uncultured Agaricales clone J2c863H（GQ924015）和Crinipellis aff. iopus JFK-2009a isolate n774（FJ167636）的相似性系數(shù)為100%，與Marasmiellus palmivorus isolate C1（JQ653443）的相似性系數(shù)為97%；LSU序列（GenBank登錄號(hào)KJ545433）的比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與Marasmiellus palmivorus isolate C6（JQ654236）和Marasmius ruforotula voucher BRMN 714674（FJ917612）的相似性系數(shù)為100%，與Moniliophthora sp. UTC 253824（JN692483）的相似性系數(shù)為98%；而SSU序列（GenBank登錄號(hào)KJ545434）的比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與Moniliophthora sp. MCA2500（AY916753）和Marasmius sp. MCA1708（AY916719）相似性系數(shù)為100%，與Crinipellis zonata strain OKM 25450（AY916691）的相似性系數(shù)為99%。由于SSU比對(duì)分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)目前還沒有Marasmiellus sp.序列提交，導(dǎo)致比對(duì)結(jié)果中沒有Marasmiellus sp.菌株的SSU序列信息。

因此綜合以上比對(duì)結(jié)果，將本研究所用的菌株鑒定為Marasmiellus sp.菌株。

3 討論

由于ITS序列比5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA更容易突變累計(jì)，被認(rèn)為是在物種或物種內(nèi)水平最有用的累計(jì)突變區(qū)域[4]。ITS目前已經(jīng)被認(rèn)為是真菌分子鑒定的條形碼[5]。但是相關(guān)研究表明，ITS對(duì)于種內(nèi)的區(qū)分不是很理想，因此，有必要結(jié)合其他的序列作為輔助的條形碼，對(duì)物種進(jìn)行鑒定[6]。

核糖體小亞基（small subunit，SSU）序列rRNA 基因是編碼rRNA 的基因，是高度重復(fù)串聯(lián)序列。 因此，核糖體小亞基rRNA 基因的測(cè)序與分析在物種鑒定與系統(tǒng)發(fā)育演化方面的應(yīng)用越來越廣泛[7]。然而SSU序列較長，一般為 1 800 bp 左右，擴(kuò)增所用時(shí)間較長，測(cè)序則需要3個(gè)反應(yīng)才能測(cè)通獲得全長序列。

LSU核糖體大亞基（large subunit，LSU）基因組的序列是位于25～28S的RNA序列。大多數(shù)分子系統(tǒng)學(xué)研究中都選擇部分片段進(jìn)行分析，相對(duì)比較保守[8]。本研究只采用LSU序列5′端900 bp的片段，獲得了較好的鑒定結(jié)果，因此根據(jù)本研究的結(jié)果，皮傘屬較為適合的條形碼為ITS+LSU。

參考文獻(xiàn)：

[1]許 峰，劉 宇，王守現(xiàn)，等. 一株野生大型真菌的分離與鑒定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（13）：176-179.

[2]尹永剛，劉 宇，許 峰，等. 一株Agaricus屬野生菌的分離與鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（3）：126-129.

[3]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR protocols： a guide to methods and applications. New York： Academic Press，1990.

[4]Wang P，Liu Y，Yin Y G，et al. Diversity of microorganisms isolated from the soil sample surround Chroogomphus rutilus in the Beijing region[J]. International Journal of Biological Sciences，2011，7（2）： 209-220.

[5]Schoch C L，Seifert K A，Huhndorf S，et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer （ITS） region as a Universal DNA barcode marker for fungi[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（16）： 6241-6246.

[6]李艷春，吳 剛，楊祝良. 我國云南食用牛肝菌的DNA條形碼研究[J]. 植物分類與資源學(xué)報(bào)，2013，35（6）：725-732.

[7]Hansen Karen，Lobuglio K F，Pfister D H. Evolutionary relationships of the cup-fungus genus Peziza and Pezizaceae inferred from multiple nuclear genes： RPB2，beta-tubulin，and LSU rDNA[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2005，36（1）： 1-23.

[8]Pfister D H，Slater C，Hansen K. Chorioactidaceae： a new family in the Pezizales （Ascomycota） with four genera[J]. Mycological Research，2008，112（5）： 513-527.