程 琦 徐松濤 饒淑梅 馬永超

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，漯河 462002)

胃癌是威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤之一。全世界每年死于胃癌的患者約78.3萬(wàn)例，死亡率僅次于肺癌，位居惡性腫瘤譜第二位[1]。我國(guó)每年新增胃癌患者約67.9萬(wàn)例，死亡49.8萬(wàn)例，成為我國(guó)癌癥死亡的第二大原因[2]。90%以上癌癥患者的死亡是由腫瘤細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的[3]。因此侵襲和轉(zhuǎn)移是影響胃癌治療效果和生存預(yù)后的重要制約因素。托芬那酸(tolfenamic acid,TA)是一種廣泛應(yīng)用的非甾體抗炎藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等作用[4]。近年來(lái)，TA對(duì)癌癥的化學(xué)預(yù)防作用已獲大量臨床和流行病學(xué)證據(jù)支持[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)，TA可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1 (specificity protein 1,SP1)表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、尤文肉瘤和胰腺癌等[6-10]。賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)是受SP1調(diào)控的下游分子，在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-13]。但目前關(guān)于TA對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用鮮有報(bào)道。本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)方法觀察TA對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并探究其可能的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；TA購(gòu)自Selleck公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；結(jié)晶紫染色液、TRIzol試劑、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購(gòu)自Corning公司；靶向LOXL2的shRNA干擾質(zhì)粒(pRS-LOXL2)和無(wú)義對(duì)照質(zhì)粒(pRS-scrambled)購(gòu)自美國(guó)Origene公司；脂質(zhì)體(Lipofectamine?2000)購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；兔抗人SP1、LOXL2、Snail、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、GAPDH單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司；LOXL2、GAPDH引物由大連寶生物公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2 d換液1次，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%時(shí)按1∶3比例傳代1次。

1.2.2藥物配制 將TA溶于二甲基亞砜(DMSO)制成100 mmol/L的儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，其中DMSO的終濃度為0.1%，對(duì)照組為含0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將SGC-7901細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h；去上清，加入100 μl含不同劑量TA(0、3、6、12、24、48、96 μmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h或48 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處OD值；依據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力(%)=(OD藥物組/OD對(duì)照組)×100%，采用SPSS18.0軟件的Probit回歸模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.4Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲 以不同劑量TA(0、3、6、12 μmol/L)處理SGC-7901細(xì)胞24 h，然后收集各組細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基制成密度為2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液；用RPMI1640培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取50 μl加至上室底部，37℃孵育1 h；下室中加入600 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，上室中加入200 μl細(xì)胞懸液，在37℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)24 h；用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min；顯微鏡下計(jì)數(shù)上室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine?2000將質(zhì)粒pRS-LOXL2和pRS-scrambled分別轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按說(shuō)明書進(jìn)行；轉(zhuǎn)染pRS-LOXL2質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞命名為shLOXL2組，轉(zhuǎn)染pRS-scrambled質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞命名為shControl組；轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 用TRIzol試劑提取總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。取2 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 1 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)。引物采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)Blast驗(yàn)證。LOXL2上游引物：5′-CTGCAAGTTCAATGCCGAGT-3′，下游引物：5′-AGTTTTGGCCACACACCATC-3′；GAPDH上游引物：5′-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3′，下游引物：5′-GGGCAGAGATGATGACCCTT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照。

1.2.7Western blot法檢測(cè)蛋白水平 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；用5×上樣緩沖液稀釋蛋白樣本，沸水浴10 min，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗LOXL2(1∶1 000稀釋)、Snail(1∶1 000稀釋)、E-cad(1∶1 000稀釋)、MMP9(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶2 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜2次；加入二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜2次；加入ECL工作液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析儀拍照。

2 結(jié)果

2.1TA對(duì)SGC-7901細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，經(jīng)不同劑量TA作用24 h或48 h后，與對(duì)照組相比，24、48和96 μmol/L TA組細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)，且隨藥物劑量的增加呈下降趨勢(shì)；3、6和12 μmol/L TA組細(xì)胞活力與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24 h和48 h的IC50分別為78.06 μmol/L和50.72 μmol/L。

圖1 TA對(duì)SGC-7901細(xì)胞活力的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of TA on cell viability of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 24 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 48 μmol/L TA group.

2.2TA對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響 如圖2所示，與對(duì)照組相比，3、6和12 μmol/L TA組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，且隨著藥物劑量的增加而減少(P<0.05)。

圖2 TA抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲Fig.2 TA suppressed invasion of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.3TA對(duì)侵襲相關(guān)蛋白水平的影響 如圖3所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同劑量TA(3、6、12 μmol/L)處理24 h后，SGC-7901細(xì)胞中Snail、MMP9、SP1和LOXL2蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，且隨TA劑量的增加呈下降趨勢(shì)(P<0.05)；E-cad蛋白水平則隨TA劑量的增加逐漸升高(P<0.05)。

圖3 TA對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Snail、E-cad、MMP9、SP1和LOXL2蛋白水平的影響Fig.3 Effect of TA on protein levels of Snail,E-cad,MMP9,SP1 and LOXL2 in SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.4TA對(duì)LOXL2的mRNA水平的影響 如圖4所示，與對(duì)照組相比，3、6和12 μmol/L TA組LOXL2的mRNA水平均顯著下降(P<0.05)，且隨TA劑量的增加呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。

圖4 TA劑量依賴性下調(diào)LOXL2的mRNA水平Fig.4 TA down-regulated mRNA level of LOXL2 in a dose-dependent mannerNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs 3 μmol/L TA group;△.P<0.05 vs 6 μmol/L TA group.

2.5敲除LOXL2基因?qū)η忠u相關(guān)蛋白水平的影響 如圖5所示，與shControl組相比，shLOXL2組LOXL2、Snail和MMP9蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，E-cad蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

圖5 敲除LOXL2基因?qū)OXL2、Snail、E-cad和MMP9蛋白水平的影響Fig.5 Effect of LOXL2 gene knockout on protein levels of LOXL2,Snail,E-cad and MMP9Note:*.P<0.05 vs shControl group.

2.6敲除LOXL2基因?qū)GC-7901細(xì)胞侵襲的影響 如圖6所示，與shControl組相比，shLOXL2組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。

圖6 敲除LOXL2基因抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲Fig.6 Knockout of LOXL2 gene inhibited invasion of SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs shControl group.

3 討論

有研究證實(shí)，TA可通過(guò)下調(diào)Slug蛋白表達(dá)抑制人鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲[14]。本研究顯示，高劑量TA(>12 μmol/L)對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。為避免細(xì)胞活力受損對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，本實(shí)驗(yàn)采用低劑量TA(3、6、12 μmol/L)處理SGC-7901細(xì)胞24 h，然后行Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲。結(jié)果顯示，TA可劑量依賴性地抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲，這可能與其下調(diào)SP1、LOXL2、Snail和MMP9蛋白水平，上調(diào)E-cad蛋白水平有關(guān)。

多項(xiàng)研究表明，LOXL2在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括胰腺癌、乳腺癌、腎癌和肝癌等[15-18]。Kasashima等[13]研究表明，胃癌病理組織中LOXL2蛋白水平與局部侵襲范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，敲除LOXL2基因可顯著抑制人胃癌OCUM-12細(xì)胞和NUGC細(xì)胞侵襲。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，抑制LOXL2可阻止裸鼠胃癌移植瘤向肺轉(zhuǎn)移[12]。本研究顯示，TA可劑量依賴性地下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中LOXL2的mRNA水平，敲除LOXL2基因可抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲并下調(diào)Snail和MMP9蛋白水平并上調(diào)E-cad蛋白水平。

E-cad是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，其胞內(nèi)段通過(guò)連環(huán)素錨定在細(xì)胞骨架上，使相鄰細(xì)胞形成穩(wěn)定連接，其表達(dá)下調(diào)或缺失是腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要標(biāo)志之一。研究表明，E-cad蛋白表達(dá)上升會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲能力減弱[19]。敲除LOXL2基因可上調(diào)腎癌細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)從而抑制其遷移和侵襲[17]。Snail是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可直接結(jié)合E-cad基因啟動(dòng)子的E-box作用元件，從而抑制其表達(dá)[20]。LOXL2高表達(dá)可通過(guò)上調(diào)Snail蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Zhu等[21]研究證實(shí)，下調(diào)Snail蛋白和上調(diào)E-cad蛋白會(huì)抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲。本研究表明，TA可能通過(guò)下調(diào)LOXL2/Snail通路促進(jìn)E-cad蛋白表達(dá)，這可能是TA抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲的機(jī)制之一。

Hong等[17]研究證實(shí)，敲除LOXL2基因可抑制腎癌細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)。MMP9屬基質(zhì)金屬蛋白酶超家族成員，可高效降解Ⅳ型膠原蛋白。Ⅳ型膠原蛋白是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，而細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是防御惡性腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲的天然屏障。惡性腫瘤細(xì)胞可通過(guò)分泌MMP9破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的完整性，侵犯周圍組織、進(jìn)而侵入血管和淋巴管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Wei等[22]研究顯示，上調(diào)MMP9蛋白表達(dá)可增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力。本研究表明，TA可劑量依賴性地抑制MMP9蛋白表達(dá)，這可能與TA下調(diào)LOXL2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，TA可在體外抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲，這可能與其抑制SP1和LOXL2表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Snail和MMP9蛋白水平，上調(diào)E-cad蛋白水平有關(guān)。本研究為豐富TA的抗腫瘤侵襲作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。