臍血間充質(zhì)干細胞移植治療失代償期肝硬化研究進展

黃海鑫，姚豫桐，王若璇，黃孝倫△

(1.遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院肝膽胰脾外科·細胞移植中心，四川 成都 610072)

病毒性肝炎以及長期大量酗酒是引起肝硬化的最主要原因。其中慢性丙型肝炎病毒感染和酗酒是西方國家最常見的病因，而我國肝硬化最常見的原因則是慢性乙肝肝炎病毒感染[1]。根據(jù)衛(wèi)生部公布的全國甲、乙類法定傳染病報告，乙肝肝炎病毒感染長期占據(jù)傳染病發(fā)病第一位，而且其新增病例快速上升。據(jù)統(tǒng)計，乙肝新增病例占病毒性肝炎的比例由2004年的79%，上升至2008年的83%。此外尚有廣泛的乙肝病毒攜帶者，而大部分乙肝病人將逐漸發(fā)展為肝硬化[2，3]。失代償期肝硬化所出現(xiàn)的上消化道大出血、腹腔積液、肝性腦病等嚴重并發(fā)癥給我國醫(yī)療領(lǐng)域帶來了巨大挑戰(zhàn)。

1 失代償期肝硬化的病理基礎(chǔ)

肝硬化的病理過程以彌漫性結(jié)節(jié)狀再生取代正常肝臟結(jié)構(gòu)為特征，同時伴有致密纖維間隔的產(chǎn)生、伴隨的實質(zhì)硬變和肝組織的最終崩解。肝細胞呈彌漫性變性、壞死、凋亡，殘存細胞再生，形成再生結(jié)節(jié)，結(jié)締組織彌漫性增生形成纖維隔，最終分割及破壞正常肝小葉結(jié)構(gòu)，代之以硬化性結(jié)節(jié)或假小葉為特征的病理性改變。最終，器官的原始結(jié)構(gòu)完全喪失，伴隨而來的是肝血管和肝內(nèi)毛細膽管結(jié)構(gòu)的嚴重扭曲。肝臟逐漸變形、變硬而發(fā)展為肝硬化。肝硬化的特征是肝門管區(qū)之間存在纖維間隔(主動間隔和被動間隔，門脈間隔和中央間隔)，再生結(jié)節(jié)和肝臟結(jié)構(gòu)異常。所有這些改變都可能導致器官的崩潰和血管的重新排列(肝竇重塑、血竇毛細血管化、肝內(nèi)分流的形成，這是由于血管生成和實質(zhì)細胞壞死/凋亡所致)。這些改變在疾病的早期階段就已經(jīng)存在，但由于肝臟代償功能較強可無明顯癥狀，在很長一段時間內(nèi)仍未被發(fā)現(xiàn)。后期則以肝功能損害和門靜脈高壓為主要表現(xiàn)，有多系統(tǒng)受累，晚期可出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病、繼發(fā)感染、脾功能亢進、腹水、肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)等并發(fā)癥[4]。

2 目前失代償期肝硬化的臨床治療方案

消除導致疾病的原因，控制原發(fā)疾病。阻斷對肝細胞進一步損壞的因素是對肝硬化的基本治療，控制原發(fā)性肝病的最有效策略是抗肝細胞纖維化治療?？共《局委熆捎糜诓《拘愿斡不∪?無論是HBV或HCV陽性者)，以獲得病毒清除。

2.1 保護肝細胞補充維生素C、E及B族維生素有改善肝細胞代謝，防止脂肪性變和保護肝細胞的作用，酌情補充，如維生素K、B12和葉酸?？寡趸瘎┤缇S生素E是典型的治療NASH的方法之一。

2.2 治療肝硬化的并發(fā)癥對癥處理失代償期肝硬化所帶來的并發(fā)癥是臨床治療中非常重要的部分。生長抑素或是特利加壓素聯(lián)合急診內(nèi)鏡治療消化道出血、靜脈曲張[5]。支鏈氨基酸輸注，維持內(nèi)環(huán)境血氨平衡及其余電解質(zhì)平衡可以有效預防肝性腦病的發(fā)生發(fā)展。針對性應(yīng)用敏感抗生素控制失代償肝硬化合并的感染。同時利尿、白蛋白輸注、凝血因子輸注可提高細胞內(nèi)液滲透壓，減少腹水的生成。針對于脾大、脾功能亢進、門脈高壓的患者，行脾切除及門奇斷流術(shù)可緩解門靜脈的持續(xù)高壓，減少消化道出血的可能，亦可提高失代償期患者的生活質(zhì)量[6，7]。對于發(fā)展為HCC的患者，在患者一般情況允許的條件下，行部分肝切除、微波消融或者TACE等外科手術(shù)干預是最優(yōu)的治療方案，可最大程度上延緩患者病情的發(fā)展。

2.3 原位肝移植是治療終末期肝病及其包括早期肝細胞癌在內(nèi)的部分病例的最根本、最有效的治療手段。但是供肝來源的嚴重短缺和昂貴的醫(yī)療費用，限制了肝移植的普及開展。

2.4 干細胞移植近年來，大量的研究和臨床試驗表明，干細胞移植是治療終末期肝病一種有效的、橋接治療手段，它能為等待施行肝移植或急性肝功能衰竭的患者爭取到更多的時間，甚至為自身肝臟的修復與再生提供機會。因此干細胞移植為眾多肝硬化等終末期肝病的患者帶來新的希望。間充質(zhì)干細胞是一種來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞，廣泛存在于骨髓、臍帶、臍血、外周血甚至脂肪中。相對而言，臍血間充質(zhì)干細胞具有來源豐富、低免疫源性、創(chuàng)傷性小、操作簡單等優(yōu)點，甚至臍血干細胞具有的旁分泌功能可以加速肝細胞的活化，使得干細胞移植技術(shù)在肝臟疾病治療中得到廣泛應(yīng)用。在近年來的臨床進展中，臍血間充質(zhì)干細胞 (hUC-MSCs)移植逐漸演變?yōu)橹委煾斡不瘡娪辛Φ氖侄?。目前看來，臍血間充質(zhì)干細胞移植是肝硬化治療中更有效、更值得推廣的治療策略，使失代償期肝硬化成為一種可治甚至是一種可逆的疾病，給眾多肝硬化患者帶來新的治療希望。

3 hUC-MSCs治療失代償期肝硬化的作用原理

臍帶血是間充質(zhì)干細胞(MSCs)采集的重要來源，也是較容易獲得的一種采集方式，相對于其他采集方式，具有更低的抗原活性、更強的增殖能力、更高的產(chǎn)出率、易應(yīng)用于臨床治療等優(yōu)點。hUC-MSCs在許多臨床研究中都被報道可以延緩肝纖維化的進展[8]。移植hUC-MSCs可能通過多種機制影響肝功能。首先，間充質(zhì)干細胞可在肝內(nèi)向肝細胞樣分化，hUC-MSCs可在肝內(nèi)沿肝細胞譜系分化成全新的肝細胞[9]，因此可替代病變肝臟中凋亡及硬化壞死的肝細胞。其次，間充質(zhì)干細胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，hUC-MSCs可以在肝內(nèi)被編程定向分化。肝內(nèi)免疫細胞就是肝內(nèi)產(chǎn)生的組織特異性因子，或是由相鄰細胞融合后的遺傳物質(zhì)組合而成，因此，hUC-MSCs可在肝內(nèi)分化增殖調(diào)節(jié)免疫能力[10]。移植的間充質(zhì)干細胞也被證明具有其他的細胞因子作用，例如，抗炎作用、分泌營養(yǎng)因子、抗肝細胞纖維化活性，抗氧化活性、限制病變組織的凋亡、促進肝組織血管化[11]；這些因素都有助于損傷的肝細胞再生[12]。此外，臍血間充質(zhì)干細胞釋放的肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)還參與了抗體中和誘導細胞凋亡的作用。證實臍血間充質(zhì)干細胞通過旁分泌機制調(diào)節(jié)活化肝細胞的功能，這也為hUC-MSCs在肝臟炎癥和纖維化中的保護作用做出了合理的解釋[13]。

4 臍血間充質(zhì)干細胞治療肝硬化的移植途徑

自hUC-MSCs廣泛應(yīng)用于臨床治療肝硬化以來，移植hUC-MSCs的途徑也逐漸多樣化。目前較為成熟的移植途徑大概分為以下幾種：①經(jīng)外周靜脈或深靜脈移植：直接將配型完畢的臍血間充質(zhì)干細胞經(jīng)外周靜脈或深靜脈移植輸注至體內(nèi)。其優(yōu)點在于：操作簡單易行，移植時間短，普通病房內(nèi)即可實施。缺點在于：第一，經(jīng)外周靜脈或深靜脈移植干細胞容易引起I型超敏反應(yīng)[14]，第二，經(jīng)輸血器濾網(wǎng)過濾后的干細胞將會損失一定量的細胞數(shù)目，達不到預期的移植效果，第三，經(jīng)外周靜脈或深靜脈移植的干細胞缺少靶向定位，最終能到達靶向器官肝臟的干細胞數(shù)目較少。以上條件都將局限干細胞最終的治療效果，但有時對于部分心肺功能較差、無法耐受麻醉、搶救急性肝功能衰竭的患者，也不失為一條可選擇的途徑。②經(jīng)肝動脈穿刺移植：于B超或介入引導下行肝動脈穿刺，經(jīng)肝動脈植入干細胞。其優(yōu)點在于：植入的干細胞定位精確，可直接由肝動脈流入肝臟內(nèi)定植。缺點在于：第一，肝動脈管徑較細，相比于門靜脈穿刺難度較高，容易出現(xiàn)其余穿刺并發(fā)癥或穿刺失誤。第二，肝動脈血流流速快，壓力高，行干細胞移植時需較大壓力才能完成植入，同時退針時動脈血管難以止血，易引發(fā)術(shù)后并發(fā)癥。③于B超或介入引導下行門靜脈穿刺，經(jīng)門靜脈植入干細胞。其優(yōu)點在于：第一、同經(jīng)肝動脈穿刺移植類似，經(jīng)門靜脈植入干細胞也有定位精確，移植的干細胞能精確流入肝臟進行定植的優(yōu)點。第二、相比于肝動脈穿刺，門靜脈具有管徑較粗，易于穿刺，靜脈血流速稍慢，壓力較小的優(yōu)點。都將相對較少穿刺的并發(fā)癥產(chǎn)生。再有，門靜脈血流占入肝血流的65%～75%，更適于干細胞的植入。缺點在于：與經(jīng)肝動脈移植同理，仍然有術(shù)后出血、穿刺失敗、門靜脈血栓形成等危險因素。綜上所述，在筆者看來，如果患者一般情況及所在醫(yī)院醫(yī)療條件允許，經(jīng)門靜脈穿刺植入干細胞是一種更為安全、有效、直接的移植途徑，有待廣泛發(fā)展應(yīng)用。

5 hUC-MSCs移植治療肝硬化的治療效果評估

筆者在閱讀大量相關(guān)治療文獻及結(jié)合所在科室進行治療臍血間充質(zhì)干細胞移植治療肝硬化患者的療效隨訪看來，80%左右經(jīng)治療患者出現(xiàn)的腹脹、納差、乏力、生活質(zhì)量差等癥狀明顯改善[15]。同時實驗室檢查方面，凝血酶原激活時間、總膽紅素、白蛋白、肝轉(zhuǎn)氨酶等均能有所改善，提示干細胞移植有利于改善患者肝功能[16～18]。目前針對于hUC-MSCs移植治療肝硬化的療效及預后的幾種評估指標主要有：①child-pugh評分：毋庸置疑，child評分仍是評價肝臟功能最經(jīng)典以及最實用的評分標準，通過患者的ALB、TBIL、PT-time、腹水以及肝性腦病來將肝臟功能分為A/B/C等級。其優(yōu)點在于評測簡便，較為實用，但相對應(yīng)的是child評分的評價內(nèi)容未評判肝臟纖維化程度，因此僅通過常規(guī)內(nèi)科治療亦可降低肝硬化患者的child評分評級，對于hUC-MSCs移植治療肝硬化的療效及預后不能做出優(yōu)異的評測。②失代償期肝臟疾病血清鈉含量聯(lián)合模型(MELD-Na)。在Kamath提出終末期肝臟疾病(model for end-stage liver disease，MELD)模型，該模型納入了TBIL、PT、INR、Cr以及病因等這幾個對患者生存產(chǎn)生的獨立的影響的變量，并依據(jù)該變量對患者的死亡的影響程度設(shè)立了相應(yīng)的權(quán)數(shù)，即MELD分值=3.8×ln(膽紅素，mg/(d·L)+11.2×ln(INR)+9.6×ln(肌酐，mg/(d·L)+6.4×(病因?qū)W：酒精性和膽汁淤積性肝硬化為 0，其他病因為 1)[19]。經(jīng)實踐后總結(jié)發(fā)現(xiàn)，MELD模型較child-pugh評級更能對于患者的預后有更好的判定，對臨床工作更具有指導意義[20]。在MELD評分的基礎(chǔ)上，Biggins等研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化后期大量腹水形成的重要因素，血清Na含量，也是一項獨立于MELD模型，可用來判定早期病死率的重要指標。經(jīng)試驗研究后，總結(jié)出MELD-Na模型，即MELD-Na=MELD 分值+1.59×[135 血清 Na+(mmol/L](血清Na+水平>0.135 mmol/L按 0.135 mmol/L 計算，血清Na+水平< 0.120 mmol/L按 0.120 mmol/L計算，血清Na+水平在兩者之間者按具體數(shù)值計算)，研究表明，MELD-Na模型可對晚期肝硬化患者的生存預后做出更準確的預算[21，22]。③彩色多普勒超聲下肝纖維化測定，是診斷肝臟疾病常用的一種快速、無創(chuàng)，具有較高特異度及敏感度的檢查方式。通過彩色多普勒超聲的檢測，可評估干細胞移植前后，肝臟內(nèi)肝動脈、門靜脈走形是否連續(xù)，肝臟表面回聲是否均勻一致，肝臟大小是否失調(diào)，以及超聲探頭試夾肝臟評估肝纖維化程度。均可對干細胞移植前后的肝臟功能做出較為準確的器質(zhì)性的評定。④吲哚菁綠15分鐘滯留率(retention rate of indo-cyanine green at 15 min，ICG R15)，是近年來臨床上用于評估肝臟細胞活性的重要指標，吲哚菁綠在靜脈注入人體后，可迅速與體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合，并通過肝臟細胞快速攝取，通過ATP轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，吲哚菁綠通過膽道隨膽汁以原有的形態(tài)直接排出肝臟，所以IGC R15只會被肝臟血流量，肝臟內(nèi)活性肝細胞數(shù)目以及膽道通暢程度影響[23]，在臨床治療過程中，我們將ICG R15用于評估肝硬化患者的肝臟儲備能力。失代償期肝病患者，ICG R15隨著病情分期約晚，肝硬化程度越重而越加升高。同時ICG R15擁有創(chuàng)傷較小，得出結(jié)果迅速，操作簡便等優(yōu)勢，亦可作為hUC-MSCs移植治療肝硬化的療效及預后的重要評價指標。

同期國外已經(jīng)有一些單一、小樣本I期臨床試驗已經(jīng)實施，并在肝硬化治療過程中得到了一定的療效。將接受臍血間充質(zhì)干細胞移植的患者作為實驗組，對照僅接受常規(guī)內(nèi)科治療的患者作為對照組。再接受細胞移植后，實驗組MELD評分(P=0.0001)、INR (P=0.012)、膽紅素(P< 0.0001)、總白蛋白(P< 0.0001)水平較基線組和對照組均有明顯改善。實驗組患者移植6個月后血清白蛋白水平升高有統(tǒng)計學意義[24]。對于MELD-Na評分、ICG R15、肝纖維化程度測定方面暫時還沒有相應(yīng)的臨床試驗數(shù)據(jù)證明。

6 總結(jié)及展望

總之，目前傳統(tǒng)的臨床藥物治療不能改善終末期肝病的預后，而全球性供體器官的嚴重短缺，供需矛盾的日益突出，使大多數(shù)患者只能在等待的過程中死亡。

臍血間充質(zhì)干細胞移植的發(fā)展及推廣無疑是為肝硬化的患者帶來的新的希望。但由于干細胞具有多向分化潛能，移植后除了改善肝臟質(zhì)地，助力肝細胞的活化以外，是否會提高腫瘤發(fā)生發(fā)展的可能仍是需進一步考慮和研究的問題。同時，臍血間充質(zhì)干細胞的移植作為新生的治療手段，在其治療過程中，是否會對人體產(chǎn)生其他不可逆的影響因素更需要深一步的研究去探索。