張 媛，黃 琰，王莉華，劉憲凱，呂國(guó)慶，吳 隼

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝453100

急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是一種造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病。隨著研究的深入和治療方法的進(jìn)步，APL已成為可以治愈的白血病之一。但是伴隨APL緩解率的提升和生存期的延長(zhǎng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)(CNSL)成為大部分APL 患者復(fù)發(fā)的首要表現(xiàn)，也是影響APL患者預(yù)后的重要因素[1]。由于目前中樞浸潤(rùn)的早期診斷缺乏特異性和敏感性，如何在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間正確評(píng)價(jià)及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，仍然是APL臨床治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)。近年來，細(xì)胞游離DNA(cfDNA)在惡性腫瘤的早期診斷以及預(yù)后預(yù)測(cè)成為研究的熱點(diǎn)。cfDNA 是指存在于血液、滑膜液等體液中的細(xì)胞外DNA，在健康人群的循環(huán)血中含量極微[2]。研究[3-4]顯示，腫瘤患者cfDNA 水平遠(yuǎn)高于正常人，并且其含量與腫瘤負(fù)荷及復(fù)發(fā)呈正相關(guān)性。本研究通過對(duì)APL 患者腦脊液cfDNA 進(jìn)行定量及定性研究，分析其在APL 合并中樞浸潤(rùn)早期診斷中的臨床價(jià)值和指導(dǎo)意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年6月至2019年8月在我院治療的APL、APL合并CNSL、結(jié)核性腦膜炎(TBM)、無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(對(duì)照組)患者各20 例，共80 例。其中男性各13例，女性各7例，年齡7～56歲，平均年齡(33.59±5.14)歲。所有APL患者均符合張之南第三版《血液病的診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。APL合并CNSL患者在符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)之外，參照1985年羅馬談?wù)撎岢龅腃NSL 的診斷意見及臨床表現(xiàn)，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞0.005×109/L。結(jié)核性腦膜炎患者的確診及排除符合國(guó)家統(tǒng)一制定的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)。以行腰椎穿刺術(shù)，并最終排除中樞系統(tǒng)疾病的患者納為對(duì)照組。排除合并風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等免疫性疾病患者，排除合并肝腎功能損傷、HIV 或皰疹病毒感染、肝炎病毒感染以及其他惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情協(xié)議書。

1.2 cfDNA定量及定性檢測(cè)

治療前APL、APL 合并CNSL、TBM、對(duì)照組患者行腰椎穿刺后留取1 mL 腦脊液，采用cfDNA提取試劑盒(廣州吉塞生物科技股份有限公司)提取腦脊液cfDNA，測(cè)量cfDNA 濃度并換算至血漿cfDNA 濃度。提取后的cfDNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較cfDNA 的片段大小及分布。

1.3 PML-RARA RT-PCR

收集APL、APL 合并CNSL、TBM、對(duì)照組患者腦脊液1 mL，采用細(xì)胞總RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cfDNA。從NCBI上查詢?nèi)嗽碢ML-RARA 核苷酸序列，并設(shè)計(jì)RT-PCR 引物。PML-RARA-F:5'-ggcagttcataatgcatc-3'；PMLRARA-R:5'-tccctgagatagggggag-3'；以U6為內(nèi)參；U6-F:5'-gtgctcgcttcggcagcac-3'，U6-R:5'-atatggaacgcttcacga-3'。根據(jù)RT-PCR 試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)說明配置反應(yīng)體系，并設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析PMLRARA 的m RNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 腦脊液生化及常規(guī)檢驗(yàn)

APL、APL合并CNSL 患者治療前、治療后分別取1 mL腦脊液進(jìn)行cfDNA 定量、常規(guī)和生化檢查、白細(xì)胞計(jì)數(shù)；采用雅培C8000 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腦脊液蛋白(M-TP)、腦脊液氯化物(Cl)和腦脊液葡萄糖(Glu)的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，兩獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析，APL、APL合并CNSL、TBM、對(duì)照組組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 cfDNA 定量及定性檢測(cè)

cfDNA定量顯示:對(duì)照組(24.40±2.96)ng/m L，TBM 患者(56.83±6.71)ng/m L，APL 患者(103.05±9.44)ng/m L，APL 合并CNSL 患者(147.61±12.15)ng/m L。與對(duì)照組、TBM 患者比較，APL患者和APL合并CNSL患者的腦脊液中cfDNA 含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組、TBM 患者的腦脊液cfDNA 片段主帶大小約為160 bp及其倍數(shù)，APL和APL 合并CNSL 患者cfDNA 片段主帶大小約為140 bp，并且片段大小不等，見圖1。

圖1 cfDNA電泳圖

2.2 RT-PCR 檢測(cè)PML-RARA 的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示:APL 患者和APL 合并CNSL患者PML-RARA 表達(dá)陽(yáng)性率分別為95%、100%，PML-RARA 相對(duì)m RNA 表達(dá)水平分別為1.26±0.20 和1.78±0.21。與APL 患者比較，APL合并CNSL 患者的PML-RARA 相對(duì)m RNA表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 治療前后腦脊液cfDNA、WBC比較

與治療前比較，APL 患者和APL 合并CNSL患者治療后腦脊液中cfDNA 和WBC 的含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與APL 患者比較，APL合并CNSL患者治療前cfDNA 和WBC的含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.4 治療前后腦脊液M-TP、Cl、Glu比較

與治療前比較，APL患者和APL合并CNSL患者治療后腦脊液中M-TP的含量降低(P＜0.05)，Cl和Glu的含量升高(P＜0.05)；與APL 患者比較，APL合并CNSL 患者治療前M-TP 的含量增加(P＜0.05)，Cl和Glu的含量下降(P＜0.05)。見表2。

表1 治療前后腦脊液cfDNA、WBC含量比較

表2 治療前后腦脊液M-TP、Cl、Glu含量比較

3 討論

cfDNA 通常來源于細(xì)胞凋亡或壞死。生理?xiàng)l件下，細(xì)胞裂解后釋放到外周環(huán)境中的cfDNA 會(huì)被實(shí)時(shí)清除并保持在較低的水平，但在腫瘤疾病中，不均衡的血液供應(yīng)和過快的新陳代謝導(dǎo)致細(xì)胞大量壞死和凋亡，原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞、循環(huán)血液腫瘤細(xì)胞、微轉(zhuǎn)移病灶和正常細(xì)胞釋放大量的cfDNA[5-6]。部分文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，炎癥亦可引起cfDNA 的升高，但未提示與腫瘤cfDNA 的含量、片段的長(zhǎng)短是否存在異常。有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血漿ct DNA 含量明顯增多，提出了外周血ctDNA 水平在監(jiān)測(cè)療效、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)方面的作用。基于cfDNA 檢測(cè)微創(chuàng)性、取材簡(jiǎn)易方便及適合動(dòng)態(tài)研究等優(yōu)點(diǎn)，在各種惡性腫瘤早期診斷、進(jìn)展、監(jiān)控及預(yù)后判斷中具有重要的臨床意義，被認(rèn)為是一種具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤靶分子的檢測(cè)方法。目前的研究顯示:cfDNA 在實(shí)體腫瘤中具有重要的意義，但是在急性白血病中應(yīng)用的文獻(xiàn)少見。本研究旨在進(jìn)一步探究cfDNA是否可以應(yīng)用于APL合并中樞浸潤(rùn)的早期診斷。

研究顯示:健康人群cfDNA 主要通過淋巴細(xì)胞和其他有核細(xì)胞的凋亡釋放，最終被降解為180～200 bp的片段，平均濃度為30 ng/m L。腫瘤患者血漿中cfDNA 的平均濃度可達(dá)180 ng/m L，而且其片段大多小于180 bp[10-11]。健康人群和良性疾病患者、惡性疾病患者的cfDNA 濃度存在重疊，因此，僅以cfDNA 濃度作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)缺乏特異性。本研究結(jié)果顯示:APL 組和APL 合并CNSL 組腦脊液中cfDNA 的含量較正常人群和TBM 患者明顯增加，cfDNA 片段大小降低，且雜帶多，提示APL、APL合并CNSL患者體內(nèi)cfDNA 的完整性遭到破壞，cfDNA 的含量與APL的發(fā)病有顯著的相關(guān)性。

90%以上的APL患者具有特異的15號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病基因(PML)和17號(hào)染色體維甲酸受體α基因(RARA)染色體易位[12-13]。15號(hào)染色體斷裂點(diǎn)位于PML 基因兩個(gè)斷裂點(diǎn)集中區(qū)域內(nèi)，17號(hào)染色體斷裂點(diǎn)位于RARA 基因的一個(gè)17 kb的內(nèi)含子2中，產(chǎn)生L 和S兩種不同長(zhǎng)度的PML-RARA 融合轉(zhuǎn)錄本[14-15]，通過RT-PCR 可準(zhǔn)確鑒定出PML-RARA 型APL。本研究結(jié)果表明，APL、APL合并CNSL患者中PML-RARA 的陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異，但APL 合并CNSL 患者的PML-RARA m RNA 表達(dá)水平較APL 患者明顯增加，提示PML-RARA 的表達(dá)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)密切相關(guān)。

為進(jìn)一步闡明cfDNA 在APL、APL合并CNSL患者鑒別診斷中的意義，對(duì)成功治療后的APL、APL 合并CNSL 患者腦脊液中的cfDNA、WBC、M-TP、Cl和Glu的含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示:與治療前比較，治療后APL、APL 合并CNSL 患者腦脊液中cfDNA 的含量均顯著下降；WBC、M-TP、Cl和Glu 的含量也隨治療療效相應(yīng)改變。此外，與APL比較，APL合并CNSL 患者治療前cfDNA 的含量更高。提示cfDNA 含量的變化在APL、APL合并CNSL患者的鑒別診斷以及APL 病程的監(jiān)測(cè)中具有重要意義。

綜上所述，cfDNA 的含量和完整性與APL 患者的病程進(jìn)展和臨床特征顯著相關(guān)，有望用于APL、APL合并CNSL的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。