甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04菌株的抑菌譜及對仁果類真菌病害的防治作用

萬丹丹，吳海霞，湯曼麗，彭 云，陳 茹，馬桂珍，暴增海*

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222000；2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇連云港222000）

蘋果輪紋病是由葡萄座腔菌屬引起的，該病菌不僅會危害生長期的果樹和果實，也會造成果實成熟期的爛果、落果，并且在貯藏期也會造成大量的爛果，是嚴(yán)重危害蘋果產(chǎn)業(yè)的病害之一。除危害蘋果外，還可侵染梨、桃、杏等多種果樹，對果樹的生長和水果產(chǎn)量造成了巨大的影響[1-2]。目前，我國輪紋病害的防治主要是依靠化學(xué)農(nóng)藥，而化學(xué)農(nóng)藥的大量使用和濫用導(dǎo)致了環(huán)境污染、生態(tài)多樣性破壞、農(nóng)藥殘留及植物病原菌產(chǎn)生耐藥性等一系列難題[3]。開發(fā)利用新型生物農(nóng)藥可彌補(bǔ)化學(xué)農(nóng)藥的不足，微生物制劑用于植物病害的防治受到了廣泛的重視[4-5]。芽孢菌屬繁殖力強(qiáng)，其芽孢可在惡劣環(huán)境中存活，并且其產(chǎn)生的細(xì)菌素、抗菌蛋白、脂肽類抗生素等產(chǎn)物具有抑菌作用，被廣泛地應(yīng)用于微生物菌劑的研制[6-8]。用于植物病害防治的微生物菌株主要來源于陸地和海洋，其中來源于陸地的生物菌株開發(fā)應(yīng)用比較普遍，而來源于海洋的微生物菌株，由于海洋特殊的生態(tài)環(huán)境，如高壓、高鹽、低溫、寡營養(yǎng)等，造就了其產(chǎn)物的特異結(jié)構(gòu)和活性是陸源微生物無法比擬的[9-11]。很多海源微生物的次生代謝產(chǎn)物對植物病害的防效更好，成為近年來的研究熱點(diǎn)。

本課題組從連云港海域分離獲得1株對輪紋病等多種植物病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04菌株。為了進(jìn)一步了解該菌株特性，筆者系統(tǒng)研究了該菌株及其發(fā)酵液的抑菌譜以及對仁果類輪紋病病害的防效，旨在為該菌株后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、培養(yǎng)基及果實來源

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04由江蘇海洋大學(xué)海洋微生物實驗室分離、鑒定、保存。供試植物病原真菌（表1）和細(xì)菌保存在該實驗室。

PDA馬鈴薯培養(yǎng)基；PD液體培養(yǎng)基；NA液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮1.0%，花生餅粉1.0%，CaCl21.0%，pH 7.5。

梨：市售雪梨；蘋果：市售紅富士。

1.2 BMF 04菌株及其無菌發(fā)酵液對植物病原真菌抑菌作用的測定

將4℃下保存的BMF 04菌株在無菌條件下轉(zhuǎn)接于PDA斜面上，在28℃的條件下培養(yǎng)1 d進(jìn)行活化；將4℃下保存的植物病原真菌在無菌條件下轉(zhuǎn)接于PDA平板上，在28℃培養(yǎng)3 d進(jìn)行活化，備用。

采用平板對峙培養(yǎng)法，在PDA平板中央接種直徑為7 mm的病原真菌菌苔，在真菌三邊距培養(yǎng)皿邊緣25 mm處劃線接種活化1 d的BMF 04菌株，以不接BMF 04菌株作為對照，3次重復(fù)。28℃培養(yǎng)3～5 d，觀測并測量抑菌帶寬度。

表1 BMF 04 菌株及其無菌發(fā)酵液對不同植物病原真菌的抑制作用測定結(jié)果

將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04接種于PDA斜面，在溫度為28℃條件下，培養(yǎng)16 h，用PD培養(yǎng)基洗下，制成菌懸液，接入裝有60 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。在溫度為28℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)16 h，得到種子液，調(diào)整種子液濃度為108CFU/mL。按照10%的接種量，將種子液接種裝入盛有60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中；在溫度為28℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液冷卻至4℃，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾去除菌體，即為無菌發(fā)酵液。

采用牛津杯法，將植物病原真菌接在直徑90 mm的平板中央，在距邊緣25 mm處對稱放置4個牛津杯，3個牛津杯中各加入無菌發(fā)酵液200 μL，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次。28℃下恒溫培養(yǎng)4 d后，觀察植物病原真菌的生長情況，并測量其抑菌帶寬度。

1.3 BMF 04菌株發(fā)酵液對不同細(xì)菌抑制作用的測定

采用牛津杯法，將斜面培養(yǎng)24 h的5種供試細(xì)菌接種至盛有60 mL NA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液均勻涂布在NA平板上，每個涂菌平板上等距離擺放4個牛津杯。牛津杯中加入200 μL BMF 04菌株的無菌發(fā)酵液，以等量的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，28℃下培養(yǎng)36 h，測定抑菌帶寬度，重復(fù)3次。

1.4 BMF 04菌株發(fā)酵液及其無菌發(fā)酵液對梨、蘋果果實輪紋病防治作用的測定

蘋果、梨果實表面的處理:選擇健康果形大小一致的蘋果和梨的果實，對其表面消毒后，在果實的赤道處打直徑為7 mm、深度為3 mm的傷口，每個果實3個傷口。用2種不同處理方法分別測定BMF 04菌株發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液的保護(hù)作用和治療作用。

保護(hù)作用：在傷口處分別用濃度為108CFU/mL BMF 04發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液100 μL處理，以等量的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，16 h接種蘋果輪紋病菌菌苔。

治療作用：在果實傷口處接種輪紋病菌菌苔，16 h后分別接種濃度為108CFU/mL BMF 04發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液100 μL。

將不同處理的果實放入相對濕度為95%左右、28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，觀察5～7 d，采用十字交叉法測量病斑直徑。每個處理設(shè)3重復(fù)，每個重復(fù)10個果實。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMF 04菌株及其無菌發(fā)酵液對不同植物病原真菌的抑制作用

從表1和圖1可見，BMF 04菌株對供試的26種植物病原真菌絲生長均具有明顯的抑制作用，對23種真菌的抑菌帶寬度達(dá)18 mm以上，其中對芒果炭疽病菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為28.67 mm，其次是小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、番茄早疫病菌，抑菌帶寬度均超過27 mm。

圖1 BMF 04 菌株對不同植物病原真菌的抑制作用

從表1和圖2可見，BMF 04菌株無菌發(fā)酵液對供試的植物病原真菌均有抑制作用，對24種真菌的抑菌帶寬度在10 mm以上，其中對蘋果輪紋病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度分別為23.50 mm和23.00 mm，對水稻胡麻斑病菌和馬鈴薯晚疫病菌抑菌作用最弱，抑菌帶寬度分別為6.67 mm和4.67 mm。

圖2 BMF 04 無菌發(fā)酵液對不同病原真菌的抑制作用

2.2 BMF 04菌株發(fā)酵液對不同細(xì)菌的抑制作用

從表2和圖3可知，BMF 04菌株對供試的金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為20.55 mm，其次是青枯病菌，抑菌帶寬度為11.83 mm，對大腸桿菌、角斑病菌和枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。

表2 BMF 04 菌株無菌發(fā)酵液對不同細(xì)菌的抑制作用

圖3 BMF 04 菌株對不同細(xì)菌的抑制作用

2.3 BMF 04菌株發(fā)酵液及其無菌發(fā)酵液對梨、蘋果果實輪紋病防治作用

從表3可見，經(jīng)BMF 04菌株發(fā)酵液處理過的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為21.03、18.03 mm，經(jīng)無菌發(fā)酵液處理過的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為24.60、22.60 mm，無菌發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為43.10、53.87 mm；BMF 04菌株發(fā)酵液對梨、蘋果的保護(hù)作用分別為61.15%、76.47%，無菌發(fā)酵液對梨、蘋果的保護(hù)作用分別為51.24%、66.72%。以上結(jié)果表明，BMF 04菌株發(fā)酵液的抑菌作用明顯優(yōu)于無菌發(fā)酵液；BMF 04菌株對蘋果和梨具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，且對蘋果果實輪紋病的保護(hù)效果優(yōu)于梨果實上輪紋病的保護(hù)效果。

從表4可知，先接種輪紋病菌，后接種BMF 04菌株發(fā)酵液的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為29.03、32.13mm，接種無菌發(fā)酵液的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為34.17、36.77 mm，無菌發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為44.53、59.10 mm；BMF 04菌株發(fā)酵液對梨、蘋果的治療作用分別為41.30%、51.77%，無菌發(fā)酵液對梨、蘋果的治療作用分別為27.67%、42.88%。以上結(jié)果表明，BMF 04菌株發(fā)酵液對蘋果、梨輪紋病具有較好的治療作用，且對蘋果果實輪紋病的治療效果優(yōu)于梨果實上輪紋病的治療效果。

對比表3和表4可以看出，海洋細(xì)菌BMF 04菌株發(fā)酵液及其無菌發(fā)酵液對蘋果、梨果實的輪紋病都具有良好的防效，且該菌株對果實的保護(hù)效果優(yōu)于治療效果。

表3 BMF 04 菌株發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液對梨、蘋果果實輪紋病的保護(hù)作用

表4 BMF 04 菌株發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液對梨、蘋果果實輪紋病的治療作用

3 結(jié)論與討論

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04菌株及其發(fā)酵液對供試的26種植物病原真菌和2種細(xì)菌均具有抑制作用，該菌株對23種真菌的抑菌帶寬度達(dá)到了18 mm以上，無菌發(fā)酵液對24種真菌的抑菌帶寬度達(dá)到了10 mm以上，其中對蘋果輪紋病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度分別為23.50 mm和23.00 mm，說明其抗菌譜較廣。目前，應(yīng)用于植物防病促生的芽孢菌屬主要為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[12]，關(guān)于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在植物病害的防治應(yīng)用近年來也有所報道。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BAC-9912、WF-3對黃瓜灰霉病和炭疽病的防效分別達(dá)78.8%、77.38%[13-14]。從海洋中分離篩選的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SHB114和BH21，能有效抑制黃瓜枯萎病、炭疽病、立枯絲核菌和葡萄灰霉病[15-16]。分離自天然餅肥發(fā)酵液的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16菌株在香蕉根際土壤和植物體內(nèi)具有良好的定殖能力，是防治香蕉枯萎病的新菌種資源[17]。趙文珺等[18]室內(nèi)盆栽實驗表明，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌NK、G-1對番茄白粉病防效分別達(dá)87.55%、47.74%，且能不同程度促進(jìn)番茄的生長。本研究中的BMF 04菌株與上述報道的菌株相比抗菌譜較廣，抗菌種類也有明顯不同。該菌株的發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液對蘋果和梨的輪紋病均具有防治作用，且保護(hù)效果優(yōu)于治療效果，發(fā)酵液的防效優(yōu)于無菌發(fā)酵液的防效，對蘋果的保護(hù)效果及治療效果分別為76.47%、51.77%。

本研究說明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04是一株具有廣譜抗菌性的海洋細(xì)菌，對果實輪紋病具有良好的防效，在植物病害的微生物防治方面具有廣泛的應(yīng)用前景。