基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術在腫瘤診斷及微生物鑒定中的應用

管明秀，張文成，王寶占，崔 喆，陳寶穎，張 霞

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是目前臨床診斷中一項創(chuàng)新技術，因其具有操作簡單、快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，越來越多地被臨床實驗室認可， 已成為精準醫(yī)學不可缺少的分子診斷技術。血清腫瘤標志物可早期篩查無癥狀癌癥患者，已經成為近年來蛋白質組學關注的熱點之一，對于癌癥患者的早期篩查、早期診斷、早期治療，以及預測癌癥患者的預后具有不可估量的重要價值。

1 MALDI-TOF MS 在癌癥診斷中的應用

傳統(tǒng)的2D 凝膠電泳技術操作復雜，耗時費力，重復性差，對于小分子的低豐度蛋白的分離效果不好［1］，不適用于臨床診斷。 MALDI-TOF MS 與磁珠技術聯(lián)合可以篩選出血清低分子量蛋白/多肽，建立癌癥蛋白標志物的指紋圖譜診斷預測模型［2，3］。

1.1 MALDI-TOF MS 在食管癌診斷中的應用食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，是臨床上比較常見的消化道腫瘤。 全世界每年大約有30多萬人死于食管癌［4］。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，病死率僅次于胃癌。 罹患食管癌的患者中，大約有80%是食管鱗狀細胞癌 （esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。 食管癌早期癥狀不明顯，70%的患者發(fā)現(xiàn)時，已經處于晚期［5］。

張婷等［6］研究發(fā)現(xiàn)，利用弱陽離子交換磁珠（WCX-MB）提取血清蛋白/多肽后，經MALDI-TOF MS 檢測59 例食管鱗癌患者及57 例健康體檢者血清，可以篩選出差異表達蛋白/肽，從而構建了食管癌診斷預測模型。 該研究通過磁珠聯(lián)合MALDITOF MS 技術，運用遺傳算法（GA），監(jiān)督神經網絡算法（SNN）以及快速分類算法（QC）建立了三種食管癌診斷預測模型，準確性分別為93.1%、89.7%和89.7%。 其中運用GA 建立的模型診斷效能最佳，特異性和敏感性分別為93.3%和92.9%。 該研究對食管癌診斷的敏感性遠高于Nakamura 等［7］研究證明食管癌的血清腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的診斷敏感性為12.5%；細胞角蛋白19 片段（CYFRA21-1）的診斷敏感性 33.9%。 張等［6］研究還發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組多肽峰m/z 2660.84 和m/z 5336.49 表達上調，兩個峰的AUCROC 值分別為0.95 和0.91， 較比健康對照組具有顯著性差異。

通過MALDI-TOF MS 建立的食管癌診斷預測模型，具有較高的敏感性和特異度，適用于食管鱗癌高危人群的篩查和輔助診斷。 多肽峰m/z 2660.84 和m/z 5336.49 有望成為新食管鱗癌診斷標志物。

1.2 MALDI-TOF MS 在胃癌診斷中的應用 胃癌是來自胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤。 全球每年胃癌的發(fā)病率約100 萬［8］，我國的胃癌發(fā)病率占全球的50%以上［9］。在我國的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，胃癌的發(fā)病率位列第 2，病死率位居第 3 位［10］。目前胃癌的早期診斷存在很大的局限性［11］，糖類抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、CEA 等血清腫瘤標志物診斷胃癌的敏感性和特異性比較低［12］。目前MALDI-TOF MS聯(lián)合磁珠技術進行低豐度蛋白/肽檢測的蛋白質組學研究成為關注的熱點［13］。

王娜娜等［14］利用 WCX-MB 聯(lián)合 MALDI-TOF MS 檢測60 例胃癌患者和60 例健康體檢者的血清，建立了相應蛋白表達指紋圖譜，篩選出差異表達蛋白/肽峰m/z 2952.57 和m/z 5904.36，兩個峰的AUCROC值分別為0.93 和0.81。運用GA 建立了胃癌診斷預測模型，該模型診斷靈敏度為93.3%，特異性為 90.0%。 YANG 等［15］利用 MALDI-TOF MS 檢測70 例胃癌患者和健康體檢者的血清，篩選出差異表達蛋白/肽峰m/z 5335.08 和m/z 1546.02，這與王娜娜等［14］篩選出的多肽峰具有相似性。 LIU 等［16］對 28例胃癌患者和16 例健康體檢者進行血清檢測，篩選出差異表達蛋白/肽峰m/z 5904.83。 以上進一步說明MALDI-TOF MS 檢測的可靠性。 WCX-MB 聯(lián)合MALDI-TOF MS 技術具有操作簡單、靈敏度高、快速等優(yōu)點， 適用于臨床診斷。 m/z 5904.36，m/z 5335.08 和m/z 5904.83 有望成為診斷胃癌的血清標志物。

1.3 MALDI-TOF MS 在甲狀腺微小結節(jié)良惡性診斷中的應用 中國抗癌協(xié)會于2016年發(fā)布了首個《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療專家共識》，認為甲狀腺微小乳頭狀癌經手術治療可根除，5年生存率能夠達到98.5%［17］，部分患者發(fā)生遠處轉移、淋巴結轉移和腫瘤復發(fā)［18］，因此，對于甲狀腺微小結節(jié)的早期良惡性鑒別、合理規(guī)范治療，以及后期隨訪都有著重大的意義。 因甲狀腺微小結節(jié)體積小，超聲檢查誤診率高，診斷符合率僅為78.8%［19］，超聲引導下的細針穿刺雖然有比較高的敏感性和特異性， 但是也有因診斷可疑或取材不滿意而延誤診斷的情況發(fā)生［20］。 磁珠聯(lián)合 MALDI-TOF MS 能夠捕獲小分子蛋白/多肽，詹宇紅等［21］通過磁珠聯(lián)合MALDI-TOF MS 技術， 對65 例甲狀腺微小惡性結節(jié)和50 例微小良性結節(jié)進行血清檢測， 篩選出差異蛋白峰 m/z 3320.19、m/z 8127.39、m/z 4302.35，構建了甲狀腺微小惡性結節(jié)診斷預測模型。 盲法監(jiān)測該診斷預測模型的敏感性為80%， 特異度為86.7%， 高于超聲檢查診斷［20］。 與盧秀波等［22］用MALDI-TOF MS 建立的甲狀腺惡性結節(jié)的診斷模型的敏感度88.0%，特異度83.0%具有一致性。 m/z 3320.19、m/z 8127.39、m/z 4302.35 有望成為甲狀腺微小惡性結節(jié)的診斷血清標志物。

2 MALDI-TOF MS 在微生物鑒定中的應用

近年來MALDI-TOF MS 在微生物鑒定領域表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。 較比微生物鑒定傳統(tǒng)的檢測方法檢測周期長， 不能滿足臨床診療時效性的需要，尤其是針對菌血癥等重癥感染的患者，MALDI-TOF MS 可以直接使用臨床樣本， 或經過分離培養(yǎng)出單菌落進行檢測，獲得蛋白質譜圖，與微生物數(shù)據(jù)庫參考圖譜進行比對，進行菌屬、菌種的鑒定，縮短了鑒定時間［23，24］。 與傳統(tǒng)檢測微生物表型和生理生化反應的方法相比，MALDI-TOF MS 具有快速、準確、高通量和低成本的優(yōu)勢［25，26］。 現(xiàn)將 MALDI-TOF MS在微生物領域鑒定中的應用闡述如下。

2.1 細菌 最近研究證明，MALDI-TOF MS 在細菌鑒定方面具有顯著的優(yōu)勢，除了常見細菌［27，28］，還能 鑒定 出厭 氧菌［29］、分 枝桿 菌［30］等。 MALDI-TOF MS 對細菌進行鑒定的主要是依據(jù)對細菌生物標志物的分子量及分子結構進行測定來完成。 細菌的生物標志物包括蛋白質、核酸和脂類［31］。 由于細菌蛋白質含量較高，具有高度保守性［32］，多樣性和豐富性，且易于提取和分離等特點，目前利用蛋白質作為細菌鑒定的生物標志物得到廣泛應用。 Camara等［33］利用 MALDI-TOF MS 檢測大腸埃希菌的菌體蛋白，鑒定出了野生型大腸埃希菌和抗氨芐西林大腸埃希菌。

利用MALDI-TOF MS 對分枝桿菌進行鑒定時，需要通過特殊的蛋白提取步驟，萃取蛋白，進行分枝桿菌蛋白標志物數(shù)據(jù)庫的建立，通過比對結果達到對分枝桿菌鑒定的目的［34］。

Zarate［35］研究證實，用 MALDI-TOF MS 通過低分子量蛋白譜的建立，對厭氧菌的鑒定結果與傳統(tǒng)細菌鑒定技術的一致率達到95.3%。 MALDI-TOF MS 在提高厭氧菌導致的內源性感染疾病的快速診斷率方面具有更高的價值。

2.2 真菌 MALDI-TOF MS 鑒定臨床常見真菌如酵母菌的準確性比較高［36］。 Becker 等［37］研究顯示MALDI-TOF MS 診斷絲狀真菌的準確率達到95.4%。 黃艷飛等［38］研究顯示使用“水平震蕩培養(yǎng)法”配合改良磁珠提取法提取蛋白，利用質譜鑒定絲狀真菌鑒定到屬的準確率可以達到99%。 目前已經建立了龐大的MALDI-TOF 絲狀真菌數(shù)據(jù)庫，這對于絲狀真菌鑒定具有可觀的臨床應用價值。

2.3 病毒 由于病毒具有細胞內寄生的特點，所以分離培養(yǎng)很困難，而且耗時長。 MALDI-TOF MS 憑借快速、高通量的特點，在病毒鑒定方面具有明顯的優(yōu)勢。 萬敏等［39］研究顯示利用 MALDI-TOF MS 對人乳頭瘤病毒（HPV）進行分型診斷的敏感性88.2%，特異度88.9%；對高危型HPV 診斷的準確率達到了100%。 MALDI-TOF MS 對于病毒的診斷與傳統(tǒng)技術相比具有很高的一致性［40］，同時又具備高通量、快速等特點，對于未來廣泛應用于病毒檢測具有廣闊的前景。

2.4 放線菌 放線菌是一類具有絲狀分枝細胞的原核微生物。 它的細胞構造、細胞壁的化學成分和對噬菌體的敏感性與細菌相同，但在菌絲形成以及外生孢子繁殖方面與絲狀真菌相似。 大多數(shù)放線菌是條件致病菌，可以導致放線菌病，造成皮膚軟組織、頭頸部、以及生殖器官膿腫［41］。 孫銘艷等［42］研究顯示來自患者膿腫皮膚的菌株，培養(yǎng)72 h 后，可見白色、細小、無溶血環(huán)的菌落，經過革蘭氏染色涂片可以見到革蘭氏染色陽性桿菌， 但是未見明顯菌絲，VITEK2 Compact 鑒定結果為肺炎鏈球菌和雙歧桿菌屬， 與染色鏡檢結果不符。 使用MALDITOF MS 進行鑒定結果為歐洲放線菌。 該研究還對菌株 DNA 進行提取，選用 16S rRNA［43］基因測序進行鑒定，鑒定結果也為歐洲放線菌，與MALD-TOF MS 鑒定結果一致。 因MALDI-TOF MS 具有高通量、快速的診斷優(yōu)勢，所以其對放線菌病的及時診斷具有非常重要的意義。

3 MALDI-TOF MS 面臨的挑戰(zhàn)

MALDI-TOF MS 雖然具有快速、高通量、敏感、特異等優(yōu)點，但是在臨床應用過程中還存在很多挑戰(zhàn)，缺乏操作的規(guī)范標準化要求，例如質量控制、樣品的前處理流程、鑒定流程、報告及審核流程、報告解釋、生物安全標準、儀器操作的標準化、數(shù)據(jù)庫的質量都會影響最終的鑒定結果。 目前大腸埃希菌和志賀菌運用MALDI-TOF MS 還不能嚴格區(qū)分，需要附加試驗才能加以鑒定［44］；對于變形桿菌的鑒定，MALDI-TOF MS 也只能鑒定到屬， 無法進行種的鑒定［45］。

MALDI-TOF MS 雖然存在一定的局限性，但通過規(guī)范標準化操作規(guī)程，完善建立的數(shù)據(jù)庫，該技術定能以高效、快速、廣泛的優(yōu)勢在腫瘤診斷領域和臨床微生物診斷領域中更好地服務于臨床，服務于患者。