徐瀾，劉艷超，安偉,高志強

(1.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000；2.山西省農科院玉米研究所，山西 忻州 034000；3.山西農業(yè)大學農學院，山西 太谷 030801)

小麥是我國重要的糧食作物、主要的商品糧和戰(zhàn)略儲備糧，其產量的穩(wěn)定直接影響著糧食安全.冬春麥混播區(qū)是我國小麥生產的重要組成部分，該地域耕地資源豐富，光熱資源充足，發(fā)展小麥生產極具潛力[1-2].然而冬春麥混播區(qū)春小麥生態(tài)類型復雜、品種較雜亂、優(yōu)良品種資源缺乏，這些現(xiàn)實問題嚴重制約著當?shù)匦←溕a的發(fā)展.科學合理地引進、篩選、馴化優(yōu)良小麥品種資源是保障小麥生產的重要措施之一.針對這一問題，高志強團隊將長江中下游地區(qū)和西南冬麥區(qū)的優(yōu)良冬播小麥品種引入到北方混播區(qū)(如忻定盆地)進行春播，即冬麥春播[3-5].冬麥春播是探索小麥品種資源更新、高效利用的一種新的途徑.研究表明，經冬麥春播試驗篩選得到的‘寧麥13’(2013產量：4 835.2 kg/hm2；2014產量：5 174.6 kg/hm2)等優(yōu)良品種的產量顯著高于當?shù)卮蝴溒贩N[3]，增產潛力較大，對其在混播區(qū)的適應性、抗逆性進一步研究有重大意義.冬春麥混播區(qū)基本屬干旱半干旱地區(qū)，近幾年春旱頻發(fā)，對于春小麥保苗、壯苗極為不利.小麥苗期是一個較為敏感的時期，是由異養(yǎng)轉變?yōu)樽责B(yǎng)的關鍵時期，這時小麥的根系下扎還比較淺，容易發(fā)生旱害.因此，冬麥春播小麥的苗期耐、抗旱性表現(xiàn)是其引種成功與否的重要影響因素之一.

在長期的進化中，植物演化出一套有效抵御逆境的生理機制.通過滲透調節(jié)物質的增加，細胞質膜部分功能的喪失，自由基的產生和清除等因素綜合作用來應對干旱脅迫[6-9].干旱脅迫抑制小麥生長發(fā)育，表現(xiàn)為植株生理特征的變化，其中可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、質膜透性等是與抗旱性密切相關的生理指標.研究表明，干旱能顯著影響小麥MDA的含量，且由于干旱脅迫造成大量的活性氧的積累，會引起細胞膜脂過氧化而產生MDA，導致MDA的含量升高并對細胞膜系統(tǒng)造成傷害，從而損害植物的生長[10-12].

抗逆性強弱受品種自身遺傳特性的制約，篩選、馴化、培育抗旱性強的小麥品種是應對干旱氣候的有效手段.為明確冬麥春播小麥品種在混播區(qū)的耐、抗旱性，本試驗以前期(2013～2015年)混播區(qū)適應性引種篩選得到的高產小麥品種‘寧麥13’‘揚麥20’為材料，利用PEG 6000模擬干旱脅迫，研究了苗期不同干旱程度處理下2個品種的植株生長變化及生理生化響應，從而比較兩品種的耐旱性強弱，為進一步研究冬麥春播小麥苗期抗旱生理機制提供參考，為混播區(qū)小麥安全生產提供備選品種及理論指導.

1 材料與方法

1.1 材料處理

以‘寧麥13’(南京)‘揚麥20’(揚州)為試驗材料，將相同種子按距離1 cm間距種進同規(guī)格的育苗盆，每品種設置12盆，待小麥生長至二葉一心期，開始干旱脅迫處理.利用PEG 6000模擬干旱脅迫，用蒸餾水配置4個梯度的處理液，即PEG 6000濃度為0(T0)、8%(T1)、16%(T2)、24%(T3)，各處理設置3次重復，分別在持續(xù)脅迫的第0天、第3天、第6天、第9天、第12天進行各項生理生化指標的測定，3次重復取平均值[12-13].

1.2 測定項目及方法

1.2.1 葉片面積 直尺測量展開葉的最長處和最寬處[14]，取平均值，見式(1)：

葉面積=最長×最寬×0.75

(1)

1.2.2 葉片相對含水量 在每個測量日同一時間，剪取‘寧麥13’‘揚麥20’相同葉位的葉片測定相對含水量(RWC)[15-16]，見公式(2)：

(2)

1.2.3 根和葉的相對電導率 剪取適量葉片，蒸餾水洗凈，濾紙吸干水分，混勻，稱取0.2 g，剪為0.5 cm左右相同規(guī)格的小段，加入20 mL蒸餾水，抽氣、并使葉片完全浸入蒸餾水中，靜置12 h；取適量小麥根系，用水清洗干凈，蒸餾水沖洗數(shù)次，濾紙吸干水分，其余同葉片操作相同.靜置12 h后，使用電導率儀測根和葉的初始電導率S1；之后將材料分別置于100 ℃水浴加熱10 min，靜置、冷卻到室溫，測電導率S2[17-18].見式(3)：

(3)

1.2.4 可溶性蛋白含量 剪取‘寧麥13’‘揚麥20’的葉片適量，混勻，稱取0.1 g，采用Tris-HCL緩沖溶液(pH=6.8)進行可溶性蛋白研磨提取，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[3].以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，在595 nm處繪制標準曲線：y=4.701 4x-0.004 6(R2=0.993 7).

1.2.5 丙二醛含量 剪取新鮮‘寧麥13’‘揚麥20’葉片適量，混勻，稱取0.5 g，加入5 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液和少量石英砂進行研磨提取，提取液離心10 min，取上清液2 mL轉移到試管中，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，搖勻，置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻，上清液轉移到離心管中，離心.取第二次離心后的上清液在450、532、600 nm處分別測定D值.對照用2 mL蒸餾水代替提取液.見式(4)：

C=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

(4)

上述式中C為丙二醛的濃度，μmol/L；A450、A532、A600分別為450、532、600 nm波長下的吸光值.

據(jù)式(5)計算‘寧麥13’‘揚麥20’葉片中丙二醛含量[19-21]：

MDA含量(μmol/g)=丙二醛濃度(μmol/L)×提取液體積(mL)/植物組織鮮質量(g)

(5)

1.2.5 抗旱系數(shù) 仿照文獻計算抗寒系數(shù)的方法，使用公式(6)求出抗旱系數(shù)[22]：

抗旱系數(shù)(%)=脅迫后測定值/脅迫前測定值×100%

(6)

1.3 統(tǒng)計分析

應用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和多重比較(Duncan新復極差法)進行差異顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 苗期干旱脅迫對小麥葉面積的影響

由表1知，冬麥春播條件下苗期干旱脅迫第0天，不同處理(T0～T3)均表現(xiàn)為揚麥20的葉面積大于‘寧麥13’，即其葉面積大小存在品種遺傳差異.T0處理下(CK)2種小麥長勢良好，第12天時‘寧麥13’(8.69 cm2)‘揚麥20’(8.65 cm2)葉面積較接近，期間2個品種分別增長了64.3%、50.2%，對應T1處理下分別增長了58.2%、42.2%，干旱脅迫影響了葉片正常生長.T1處理下2個品種的葉面積在第9天接近，第12天‘寧麥13’超過‘揚麥20’；T2處理下2個品種的葉面積在第6天較接近，第9天‘寧麥13’超過揚麥20；T3處理下第9天時‘揚麥20’葉片已缺水萎蔫無法測定，‘寧麥13’葉片生長正常，但葉面積較同一時期T1、T2略小.同時，干旱脅迫(T1)第12天時2個品種葉面積均顯著小于其CK(P<0.05)，持續(xù)干旱脅迫(T1～T3)對‘寧麥13’、‘揚麥20’的葉片生長均造成不同程度的傷害；隨著脅迫推進，‘寧麥13’逐漸縮小了與‘揚麥20’的葉面積差異，即‘寧麥13’的葉片在干旱逆境脅迫下生長力表現(xiàn)強于‘揚麥20’.T2、T3處理下對小麥葉片造成了不可逆的損害，抑制了小麥的正常生長.

2.2 苗期干旱脅迫對小麥葉片相對含水量(RWC)的影響

T0處理下，冬麥春播小麥品種‘寧麥13’‘揚麥20’的RWC在苗期基本穩(wěn)定，隨著干旱脅迫梯度(T1～T3)的增加，不同時期(9～12 d)2個品種的RWC均顯著下降(P<0.05).T1處理下第6天‘揚麥20’的RWC首先降到80%以下，T2處理下第12天‘揚麥20’‘寧麥13’的RWC分別為30.05%、39.78%，T3處理下第9天已下降到30%左右，第12天‘揚麥20’葉片枯萎死亡，此時‘寧麥13’的RWC亦下降到19%.干旱脅迫12天時T1處理使‘寧麥13’‘揚麥20’的RWC分別下降11.3%、15.2%，T2處理RWC下降54.2%、63.6%.苗期持續(xù)干旱脅迫導致小麥葉片細胞水分虧缺甚至死亡，且干旱脅迫對‘揚麥20’葉片造成的不良影響更加嚴重.

表1 苗期干旱脅迫對小麥葉面積的影響

表2 苗期干旱脅迫對小麥葉片相對含水量的影響

2.3 苗期干旱脅迫對小麥根、葉電導率(REC)的影響

由表3知，冬麥春播條件下，‘寧麥13’‘揚麥20’的苗期相對電導率均為根系REC高于葉片REC兩倍之多，T0處理下葉片REC為‘寧麥13’略高于‘揚麥20’，而根系REC是后者高于前者.‘揚麥20’在干旱脅迫第3天測定時葉片REC表現(xiàn)為T2、T3處理顯著高于T0、T1，而‘寧麥13’各處理間差異不顯著(P<0.05)；‘揚麥20’在干旱脅迫第3天測定時根系REC表現(xiàn)為T1、T2、T3處理間差異不顯著，但均顯著高于T0；‘寧麥13’根系REC則為T2、T3處理顯著高于T0、T1(P<0.05)，即‘寧麥13’在T1處理下受干旱脅迫影響較‘揚麥20’為小.第6天及以后‘揚麥20’的根、葉REC在不同處理間差異均顯著：T0

表3 苗期干旱脅迫對小麥根、葉相對電導率的影響Table 3 Effects of drought stress on REC of wheat root and leaf at Seedling Stage %

2.4 苗期干旱脅迫對小麥葉片可溶性蛋白、丙二醛含量的影響

可溶性蛋白含量是衡量植物抗逆性的一個重要指標.由表4知，脅迫處理前‘揚麥20’的葉片可溶性蛋白含量比‘寧麥13’低14.2%，T0處理下隨幼苗生長推進2個品種的葉片可溶性蛋白含量變化不明顯.干旱脅迫第9天開始，2個品種不同程度地出現(xiàn)葉片可溶性蛋白含量的顯著變化.脅迫第9天時，‘寧麥13’的葉片可溶性蛋白含量差異顯著性為T0

表4 苗期干旱脅迫對小麥葉片可溶性蛋白含量、MDA含量的影響

MDA的產生會加劇細胞膜質的損傷，因此，在植物抗性生理實驗研究中其含量是衡量植物抗逆性的一個常用指標.由表4知，正常情況下(T0)隨幼苗生長推進兩品種的葉片MDA含量變化不顯著或略有增加.脅迫第6天，‘寧麥13’‘揚麥20’在T3處理下MDA含量分別為5.53、7.09 μmol/g；‘寧麥13’各干旱處理的MDA含量均顯著高于CK，‘揚麥20’僅T3處理顯著高于其它處理，T0、T1、T2之間差異并不顯著；第9天時2個品種各處理間基本差異均顯著，‘寧麥13’‘揚麥20’的MDA含量在干旱脅迫T3處理下比對照T0分別高82%、78%.可見，干旱脅迫加重小麥葉片細胞膜質過氧化，隨脅迫程度及時間增加導致MDA含量顯著增加.

2.5 苗期干旱脅迫下小麥各項指標的抗旱系數(shù)分析

根據(jù)各項抗旱指標的測定值，用公式求出單項指標的抗旱系數(shù)(表5)，其中MDA含量的抗旱系數(shù)最大，可見冬麥春播小麥苗期對持續(xù)干旱脅迫比較敏感，在葉片含水量緩慢下降的同時細胞膜質過氧化程度已大大增加.除根REC外，其余各項指標均表現(xiàn)為‘寧麥13’的抗旱系數(shù)大于‘揚麥20’，其中蛋白質含量的抗旱系數(shù)2個品種基本一致.干旱脅迫對苗期‘寧麥13’、‘揚麥20’均產生顯著影響，抑制了其葉片的正常生長的，葉片含水量顯著下降，根、葉相對電導率、蛋白質含量、MDA含量均不同程度地增加，2種小麥在濃度≥24%的PEG 6000的脅迫處理下均不能正常生長；在濃度8%的PEG 6000處理下持續(xù)12 d，幼苗可以正常生長；但PEG6000濃度達16%時，幼苗正常生長只能堅持9 d.干旱脅迫下植株的生長是一個復雜的生理生化過程，2個品種對于試驗中不同抗旱指標的響應亦有所差別.

表5 苗期干旱脅迫下小麥各指標的抗旱系數(shù)

3 討論

植物抗旱性是一個涉及植物形態(tài)、生理生態(tài)特征及生理生化變化的綜合反應，是由多種基因控制的復雜性狀，利用單一指標評價具有很大的局限性和不確定性[22-23]，評價的結果會具有較大差異.本試驗根據(jù)文獻及前期研究基礎，選取相對電導率等5個關鍵指標來研究2種小麥對苗期干旱脅迫的響應，以消除單一指標的片面性，以期可以較為準確的評價其抗旱性.文獻表明，小麥遭受干旱脅迫，其相對電導率增加，葉片相對含水量降低，植物體內的可溶性蛋白和丙二醛含量會增加[10,12,24]；這與本試驗研究結果所涉及的各項指標變化趨勢基本一致.

相對電導率可以指示脅迫對植物的傷害率，‘寧麥13’的葉REC上升幅度較‘揚麥20’小，表明‘寧麥13’的葉片受到傷害較小，但‘寧麥13’根REC變化范圍較‘揚麥20’根REC為大.由此推斷，干旱脅迫從根傳到葉的過程中，會誘導植物不同部位發(fā)生不同程度的生化反應，引起‘寧麥13’根系細胞離子滲漏嚴重，同時刺激其葉片產生保護作用，出現(xiàn)了根、葉不同部位對干旱脅迫響應的表現(xiàn)不盡一致，具體原因有待進一步研究.由于‘寧麥13’的葉片細胞質膜受到的傷害較小，因此在相同的干旱脅迫下其RWC高于‘揚麥20’；葉片含水量高，葉片的增長速度較快，試驗亦證明‘寧麥13’的葉面積增幅較‘楊麥20’為大.

可溶性蛋白的含量亦是植物抗旱性的重要指標之一.植物組織里的可溶性蛋白是重要的滲透調節(jié)物質和營養(yǎng)物質，王保莉[20]等研究指出，干旱脅迫會導致植物新脅迫蛋白產生，新脅迫蛋白產生后能維持細胞內較低的滲透勢，具有良好的滲透調節(jié)作用；與本研究結果一致：T1、T2處理下‘寧麥13’‘揚麥20’的葉片可溶性蛋白含量均表現(xiàn)為增加(分別為23.4%、25.5%和32.7%、35.0%)，即冬麥春播小麥遭遇苗期干旱脅迫，均依靠合成更多的蛋白質來調節(jié)自身的滲透勢，以此適應一定范圍內的干旱脅迫.但候明[25]等研究指出，可溶性蛋白在短時間、低濃度的脅迫下會升高，隨著時間和脅迫程度的增加，可溶性蛋白含量會降低；可以理解為，植物通過合成滲透調節(jié)物質蛋白質等來適應脅迫的能力是有限的，當脅迫強度超過植物自身可調節(jié)范圍時，植物組織內可溶性總蛋白含量因遭受脅迫破壞會下降.

大量研究表明[25-28]，干旱脅迫對植物體內細胞質膜造成不同程度的損傷，最終引起離子和滲透物質的失衡；同時，干旱脅迫下，大量的活性氧在植物體內積累，加劇質膜結構和完整性的破壞.膜脂過氧化產物MDA，會反過來降低抗氧化物的含量及抑制抗氧化酶的活性.因此，MDA含量可作為植物抗旱的重要生理指標之一.本研究結果亦表明，PEG 6000模擬的干旱脅迫下，小麥葉片MDA的含量均明顯高于對照組，隨著脅迫時間的延長，‘寧麥13’的漲幅較‘揚麥20’為大，MDA含量的升高表明干旱脅迫會造成酶保護反應和自由基生成的動態(tài)平衡失衡，進而造成膜脂過氧化的程度升高.

本試驗選用‘寧麥13’(5 174.6 kg/hm2，4 835.2 kg/hm2)、‘揚麥20’(3 330 kg/hm2)為材料，該2個品種經多年冬麥春播引種試驗證明，在忻定盆地栽培條件下適應性較強，具有穩(wěn)產、多抗等優(yōu)良性狀，產量均高于當?shù)卮盒←溒贩N[3].而且這2個品種亦是冬麥春播小麥的代表類型(發(fā)育進程、穗部性狀等不同)，苗期干旱脅迫T3處理持續(xù)9 d時，‘寧麥13’‘揚麥20’開始無法正常測定相關指標，葉片萎蔫甚至死亡，可見24%的PEG 6000干旱脅迫超過了小麥承受范圍，沒有實際意義.T1處理下的兩種小麥基本能正常存活并且與T0處理下各指標差距較小，根據(jù)前文整體指標分析，冬麥春播小麥苗期的抗旱范圍大約在0～16%的PEG 6000之間.

4 結論

采用PEG 6000模擬干旱脅迫12 d之內，‘寧麥13’‘揚麥20’可能忍受干旱的存活范圍的濃度為0～16%；苗期干旱脅迫不同程度地導致小麥葉片生長緩慢、含水量顯著下降，根、葉相對電導率上升且根系表現(xiàn)更加敏感；同時，干旱誘導蛋白質含量增加：23.4%～35.0%；葉片MDA含量增加最為顯著(抗旱系數(shù)為169.9%～229.6%)，可作為監(jiān)測小麥苗期干旱脅迫的首選指標.比較而言，‘寧麥13’的葉面積生長較快，膜脂過氧化程度低，細胞質膜受傷害程度也較小，苗期抗旱性更強，可作為忻定盆地冬麥春播引種的優(yōu)選品種.