丁輝，李麗，張樹武，徐秉良，武娜娜，劉佳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

甘肅省是我國(guó)蘋果的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)和生產(chǎn)大省，2017年全省蘋果栽培面積已經(jīng)達(dá)到24.33 hm2，躍居全國(guó)第2位，且產(chǎn)量達(dá)397.92萬t，同比增長(zhǎng)10.5%[1].蘋果產(chǎn)業(yè)己成為甘肅省重要的經(jīng)濟(jì)組分[2].然而，近年來隨著果樹種植面積的逐漸擴(kuò)大，受栽培管理技術(shù)的滯后和樹齡老化等因素的影響，蘋果病害的發(fā)生連年加重，尤其是蘋果斑點(diǎn)落葉病的發(fā)生最為普遍和嚴(yán)重，已成為威脅全省蘋果產(chǎn)業(yè)的重要因素之一[3].蘋果斑點(diǎn)落葉病大量發(fā)生時(shí)，可造成果樹提早落葉和落果，嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)量，尤其在連年受害時(shí)，可導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱并縮短果樹的壽命[4].

目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的防治主要依靠傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑，如戊唑醇、烯唑醇、代森錳鋅和撲海因等[5].但隨著以上藥劑的不合理施用，嚴(yán)重破壞了果園生態(tài)環(huán)境，影響果實(shí)品質(zhì)[6].因此，化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，不但帶來了食品安全問題，而且導(dǎo)致蘋果斑點(diǎn)落葉病菌產(chǎn)生耐藥性[7].礦物源藥劑是一類有效成分源于天然礦產(chǎn)無機(jī)物和礦物油的制劑，包括硫化物、砷化物、磷化物、銅制劑、氟化物和礦物油等，?？捎米鳉⒕鷦?、殺蟲劑、殺鼠劑和除草劑等，是農(nóng)藥發(fā)展初期的主要品種[8].氧化亞銅、石硫合劑、堿式硫酸銅、硫懸浮劑、氫氧化銅、氧氯化銅和波爾多液等礦物源藥劑具有毒性低、對(duì)人畜及害蟲天敵比較安全且對(duì)病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[9].同時(shí)，礦物源藥劑與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比具有殺菌范圍廣、不易誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗藥性、安全性強(qiáng)和對(duì)常見的真菌及細(xì)菌性病害具有較好的防治作用[10]，并且還具有耐雨水沖刷和持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，

近幾年被廣泛應(yīng)用于植物病害的防治中[11].許美良等[12]的研究表明綠穎對(duì)黃瓜白粉病具有較好的防治效果，且對(duì)黃瓜具有促生作用.韓盛等[13]研究表明77%氫氧化銅干懸浮劑、37.5%氫氧化銅懸浮劑和波爾多液對(duì)加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病具有較好的防治效果.何紅衛(wèi)[14]研究發(fā)現(xiàn)礦物源農(nóng)藥綠穎對(duì)草莓白粉病菌具有較好的抑制作用.陳臻等[15]研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸能夠抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲的生長(zhǎng)且其濃度越高抑制效果越顯著.因此，以上研究結(jié)果表明礦物源藥劑在其他農(nóng)作物病害防治方面已得到了長(zhǎng)足發(fā)展，但應(yīng)用礦物源藥劑防治蘋果斑點(diǎn)落葉病的發(fā)生和危害目前尚未有報(bào)道.

因此，本試驗(yàn)測(cè)定了4種礦物源藥劑對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌的抑制作用以及對(duì)離體葉片的保護(hù)效果，旨在篩選獲得對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病防效較佳的礦物源藥劑種類及最適濃度，為蘋果斑點(diǎn)落葉病的防治提供理論依據(jù)，并對(duì)減少環(huán)境污染、保障農(nóng)產(chǎn)品安全和改善化學(xué)藥劑對(duì)病原菌產(chǎn)生耐藥性等方面具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌 供試蘋果斑點(diǎn)落葉病菌為鏈格孢蘋果專化型(Alternariamali)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 供試藥劑 供試4種藥劑均購(gòu)買于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)藥市場(chǎng)，藥劑具體情況見表1.

表1 供試藥劑

1.1.3 供試葉片 供試葉片采集于甘肅省蘭州市西固區(qū)崔家崖村蘋果園，品種為‘新紅星’，樹齡為6 a.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果斑點(diǎn)落葉病菌活化及培養(yǎng) 挑取保存于4 ℃冰箱的蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌絲，接種于PDA培養(yǎng)基中，并置于25 ℃、16 h光照和8 h黑暗的恒溫箱中培養(yǎng)5 d.重復(fù)上述步驟進(jìn)行二次純化，得到的菌種用于接種試驗(yàn)并保存?zhèn)溆?

1.2.2 含藥培養(yǎng)基制備 利用無菌水將氫氧化銅、波爾多液、硫酸銅鈣和氧化亞銅按照藥劑推薦濃度配制成水劑，并將其加入未凝固的PDA培養(yǎng)基(70 mL)中充分搖勻，制成不同質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基(表2).

表2 4種供試藥劑質(zhì)量濃度

1.2.3 不同礦物源藥劑對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抑制效果及室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌落生長(zhǎng)速率法[16].將分離活化好的蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌餅(d=5 mm)接種于不同處理的含藥培養(yǎng)基中，以加入無菌水的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后觀察菌落生長(zhǎng)狀況并采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑，測(cè)至第5天并計(jì)算菌落生長(zhǎng)抑制率和藥劑EC50[17].計(jì)算方法如下：

菌落生長(zhǎng)抑制率(%)= [(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑) / (對(duì)照菌落直徑-0.5)]×100

將抑制率轉(zhuǎn)化為機(jī)率值，藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為藥劑濃度對(duì)數(shù)，令各藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為x，且令抑菌率的機(jī)率值為y，根據(jù)公式得出供試藥劑質(zhì)量濃度EC50值，并且比較各藥劑的毒力效果.

1.2.4 不同礦物源藥劑對(duì)離體葉片保護(hù)效果測(cè)定 采用離體葉片接種法[18].將采摘的蘋果葉片經(jīng)自來水沖洗干凈，利用75%酒精消毒15 s，并用無菌水沖洗3次.然后置于超凈工作臺(tái)晾干后燙傷.將已配制好的4種藥劑的最佳質(zhì)量濃度(經(jīng)毒力測(cè)定篩選出的最佳濃度)噴施于葉片，待葉片晾干后將培養(yǎng)3 d的蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌餅(d=5 mm)接種于傷口，每個(gè)葉片1個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)處理重復(fù)3次，以噴施無菌水后接種病原菌的處理作為對(duì)照.在25 ℃的溫度下保濕培養(yǎng)10 d后，采用“十字交叉法”測(cè)量病疤長(zhǎng)徑和短徑，并計(jì)算病疤面積和保護(hù)效果.

病疤面積(cm2)= 1/4×π×長(zhǎng)徑×短徑

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007整理，利用DPS 7.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及其差異顯著性檢驗(yàn) (Duncan氏新復(fù)極差法).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同礦物源藥劑對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的毒力效果

不同質(zhì)量濃度的礦物源藥劑對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的菌落生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用，且隨著礦物源藥劑質(zhì)量濃度的升高抑菌活性均逐漸升高.與對(duì)照相比，當(dāng)77%硫酸銅鈣、80%波爾多液、77%氫氧化銅和86.2%氧化亞銅的最高質(zhì)量濃度分別為1.28、2.67、0.26、0.17 μg/mL時(shí)，接種培養(yǎng)5 d后，其抑菌率分別為81.22%、90.24%、91.01%和93.38%.同時(shí)，隨著4種礦物源藥劑質(zhì)量濃度的升高，抑菌活性趨勢(shì)均逐漸升高，接種培養(yǎng)第5天時(shí)其EC50值分別為0.780 4、0.419 2、0.140 7、0.112 0 μg/mL(表2)，其中氧化亞銅在4種藥劑中對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的抑制率最高，當(dāng)質(zhì)量濃度分別為0.17(圖1-B)、0.14(圖1-C)、0.12(圖1-D)、0.11(圖1-E)和0.10 μg/mL(圖1-F)時(shí)，抑菌率隨著藥劑質(zhì)量濃度的升高而上升，分別為32.23%、50.03%、60.88%、77.11%和93.38%.

A：CK；B～F：氧化亞銅濃度分別0.17、0.14、0.12、0.11和0.10 μg/mL. A:CK；B～F：copper hydroxide concentration was 0.17，0.14，0.12，0.11 and 0.10 μg/mL，respectively.圖1 不同質(zhì)量濃度氧化亞銅對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的抑制效果Figure 1 Inhibitory effect of cuprous oxide at different concentrations on Alternaria mali

表2 4種礦物源藥劑對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌落生長(zhǎng)的影響

2.2 不同礦物源藥劑對(duì)接種病原菌的離體葉片的保護(hù)效果

與對(duì)照相比，4種礦物源藥劑對(duì)接種蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌的離體葉片均具有不同程度的保護(hù)效果.處理10 d后，氧化亞銅對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制效果最好，面積僅為0.24 cm2，保護(hù)效果為92.35%(圖2-E)，與對(duì)照相比差異顯著(圖2-A)，且優(yōu)于其他3種藥劑.氫氧化銅處理的病斑面積為0.39 cm2，保護(hù)效果為87.79%(圖2-B)；波爾多液處理的病斑面積為1.02 cm2，保護(hù)效果為67.98%(圖2-C)；硫酸銅鈣處理的病斑面積為0.48 cm2，保護(hù)效果為84.81%(圖2-D).同時(shí)，隨著4種礦物源藥劑質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)葉片的保護(hù)效果越好(表3).

A：CK；B：氫氧化銅；C：波爾多液；D：硫酸銅鈣；E：氧化亞銅.A：CK；B：copper hydroxide；C：cordeaux solution；D：copper calcium sulfate；E：cuprous oxide.圖2 不同礦物源藥劑對(duì)接種蘋果斑點(diǎn)落葉病原菌的離體葉片的保護(hù)效果Figure 2 Protection effect of different mineral source agents on in vitro leaves of apple after inoculation with Alternaria mali

表3 4種不同礦物源藥劑對(duì)離體葉片的保護(hù)效果

3 討論

目前，蘋果斑點(diǎn)落葉病仍以傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治為主，但長(zhǎng)期不合理使用不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，顯著降低防治效果，而且造成環(huán)境污染.礦物源藥劑具有對(duì)病原菌不易產(chǎn)生抗藥性且毒性低的特點(diǎn)，是傳統(tǒng)藥劑的可替代選擇.本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同礦物源藥劑(氫氧化銅、波爾多液、硫酸銅鈣、氧化亞銅)對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌均有明顯的抑制作用，其中氧化亞銅對(duì)病原菌的抑菌效果及對(duì)離體葉片保護(hù)效果最好，且隨著藥劑質(zhì)量濃度的升高保護(hù)效果越好，這與林維碧等[19]對(duì)辣椒炭疽病的田間藥劑試驗(yàn)結(jié)果一致，86.2%氧化亞銅的防治效果達(dá)到74%，防治和治療效果均明顯高于70%的甲基托布津并具有增產(chǎn)作用.葉建春等[20]研究表明氧化亞銅是一種防治荔枝霜疫霉病較好的殺菌劑.王麗慧等[21]研究發(fā)現(xiàn)，氧化亞銅還可用于防治黃瓜霜霉病，且防治效果優(yōu)于傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑.以上學(xué)者的研究結(jié)果表明，氧化亞銅對(duì)部分作物的病害有較好的防治效果，而本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)氧化亞銅對(duì)接種蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌的離體葉片有較好的保護(hù)作用，且優(yōu)于其他3種礦物源藥劑.研究結(jié)果為礦物源藥劑在蘋果斑點(diǎn)落葉病的田間防治和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ).

然而，由于銅離子在不同作物、不同部位以及不同生長(zhǎng)階段的敏感性不同，施藥時(shí)間和部位也是決定藥效的關(guān)鍵因素[22].果實(shí)生長(zhǎng)期是蘋果斑點(diǎn)落葉病最易發(fā)病的時(shí)期，要盡早在果樹萌芽期對(duì)嫩芽進(jìn)行早期噴藥預(yù)防，發(fā)病前噴藥可以大幅減輕病害的發(fā)生，且盡量避免在雨前噴藥[23].楊君麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)氧化亞銅對(duì)辣椒疫霉菌和根腐病菌的抑制效果不同，所以氧化亞銅在不同作物上的用藥量也會(huì)影響其對(duì)病害的防治效果.同時(shí)，本試驗(yàn)有關(guān)氧化亞銅對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的田間防治效果還需進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過室內(nèi)毒力測(cè)定和離體葉片試驗(yàn)的結(jié)果表明，4種礦物源藥劑對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的菌落生長(zhǎng)均有抑制作用且對(duì)接種蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的離體葉片具有較好的保護(hù)效果，其中氧化亞銅的作用效果明顯優(yōu)于其他3種藥劑.因此，氧化亞銅可以替代傳統(tǒng)化學(xué)制劑，作為防治蘋果斑點(diǎn)落葉病的最佳礦物源藥劑.