楊步君，于少明

（合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽 合肥 230009）

氧化亞銅禁帶寬度為2.2eV，是一種典型的金屬缺位p型半導(dǎo)體。因其獨(dú)特的晶體結(jié)構(gòu)、禁帶寬度，氧化亞銅具有光學(xué)性能、磁學(xué)性能、催化性能、傳感性能[1-2]。此外，氧化亞銅還具有很好的抑菌性能，可應(yīng)用在海洋防污、抗菌紡織品、污水治理等領(lǐng)域[3-4]。

由于氧化亞銅的生產(chǎn)成本較低，抑菌效果好，因而備受研究者的關(guān)注。Pang等[5]合成了不同形貌的氧化亞銅并研究了其抗菌活性，結(jié)果表明，立方體氧化亞銅的抗菌活性具有廣譜性，而八面體氧化亞銅的抗菌活性具有高選擇性。Lee等[6]合成了具有{111}晶面的八面體氧化亞銅和具有{100}晶面的立方體氧化亞銅，通過兩者對大腸桿菌的抑菌性對比，發(fā)現(xiàn)后者的抑菌性較好，從而得出氧化亞銅{100}晶面在對大腸桿菌的抑制作用中發(fā)揮重要作用的結(jié)論。Jung等[7]采用溶劑熱的方法合成了八面體、截?cái)喟嗣骟w、截?cái)嗔庑问骟w等一系列形貌的氧化亞銅，在這些不同形貌的氧化亞銅中只有{111}和{110}兩種晶面，通過對大腸桿菌的抑菌性對比，他們發(fā)現(xiàn)，{110}晶面的氧化亞銅比{111}晶面的氧化亞銅對大腸桿菌的抑菌性更好。Ren等[8]研究了{(lán)100}晶面的立方體和{111}晶面的八面體晶型的氧化亞銅對大腸桿菌的抑菌性，發(fā)現(xiàn)后者的抑菌性更好，電動(dòng)電勢測量證明了八面體氧化亞銅和大腸桿菌之間的靜電作用比立方體氧化亞銅和大腸桿菌之間的靜電作用更強(qiáng)，而這種靜電作用有利于殺死細(xì)菌。

從上述討論可以看出，形貌和晶面對氧化亞銅的抑菌性有很大影響，人們一直在對其進(jìn)行研究，但結(jié)論并不一致，有些甚至相悖，因此可能還會有其他因素導(dǎo)致氧化亞銅抑菌性的差異，對此還需要進(jìn)一步探究?；诖?，本文采用簡便易行的化學(xué)沉淀法制備了花簇狀氧化亞銅，以大腸桿菌為受試菌種，通過平板菌落計(jì)數(shù)法和振蕩接觸法探究其與立方體氧化亞銅的抑菌性差異，進(jìn)而探究影響氧化亞銅抑菌性能的主要因素，同時(shí)探討了氧化亞銅的抑菌機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

氫氧化鈉、五水硫酸銅、聚乙二醇2000、抗壞血酸、無水乙醇、氯化鈉、二水氯化銅、乙二醇和葡萄糖，均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨（LP0042）、酵母浸粉（LP0021），購自英國 Oxoid公司；瓊脂（BR），購自北京索萊寶科技有限公司。

SPX-250生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠）；ZWYR-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州安泰安醫(yī)療機(jī)械廠）；D/MAX2500V X射線衍射儀（日本理學(xué)電機(jī)公司）；JSM-6700LV場發(fā)射掃描電鏡（日本電子制造公司）；NOVA-2200e比表面和孔隙分析儀（美國Quantachrome公司）。

1.2　氧化亞銅的制備

將20mL 0.5mol/L硫酸銅溶液和0.1g聚乙二醇2000加入到250mL單口燒瓶中，磁力攪拌下，將0.5 mol/L 40mL氫氧化鈉溶液加入到上述溶液中，攪拌30 min后加入50mL0.1mol/L抗壞血酸溶液，繼續(xù)攪拌30 min。反應(yīng)結(jié)束后離心分離得到氧化亞銅，用去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)次后置于烘箱中，80℃下干燥2h[9]。

作為對比，依據(jù)本課題組之前的研究條件制備了立方體氧化亞銅[10]。

1.3　表征

采用D/MAX2500V型X射線衍射分析儀（Cu靶Kα射線作為發(fā)射源）對樣品進(jìn)行物相分析，測試電壓為 40kV，電流為 100mA，掃描范圍 2θ 為 10°～80°，掃描速度為5°/min；采用SU8020型掃描電子顯微鏡觀察產(chǎn)品形貌與結(jié)構(gòu)，點(diǎn)分辨率為2nm；加速電壓為1～15 kV；放大率為×20～800000。

1.4　抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1培養(yǎng)基配制

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：取10g NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物放入搪瓷缸中，加1L水，攪拌使其溶解，用NaOH溶液將pH調(diào)至7.0左右，分裝在50mL錐形瓶中，用紗布、報(bào)紙和棉線包扎，并于121℃下滅菌20min。

LB固體培養(yǎng)基：在100mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入1.2g瓊脂，在封閉電爐上加熱融化，稍冷后用NaOH溶液將pH調(diào)至7.0左右，分裝在25mL錐形瓶中，加塞，包扎，并置于高壓滅菌鍋中于121℃下滅菌20min。

樣品培養(yǎng)基：取2mg氧化亞銅加入到上述配制的LB固體培養(yǎng)基中，加塞，包扎，并與生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）、培養(yǎng)皿、道夫管、涂布棒等一起置于高壓滅菌鍋中121℃下滅菌20min。

1.4.2平板菌落計(jì)數(shù)法[11]

用75%酒精噴灑擦拭超凈工作臺臺面，并在紫外燈下照射30min。然后在超凈工作臺上將上述樣品培養(yǎng)基混勻趁熱倒入表面皿中，冷卻凝固備用。用生理鹽水將活化后的大腸桿菌菌液梯度稀釋至10-7，用移液槍吸取200μL稀釋后的菌液注射在樣品培養(yǎng)基上，并用涂布棒涂勻。在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察菌落數(shù)量。

1.4.3振蕩接觸法[12]

取2mg氧化亞銅放在錐形瓶中并標(biāo)記，加入20mL生理鹽水，加塞包扎，放入滅菌鍋中121℃下滅菌20 min。取出放入超凈工作臺上，紫外燈照射下冷卻，稀釋三次至濃度梯度為10-7，從中吸取200μL加入到上述加入了氧化亞銅的生理鹽水中，用紗布包扎放到37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中（振蕩頻率250r/min）培養(yǎng)。在氧化亞銅與大腸桿菌接觸10、20和30min時(shí)取出錐形瓶，在超凈工作臺上，充分振蕩混勻后，取出200μL溶液，在事先冷卻好的盛有LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布，標(biāo)號，倒置放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌生長情況。

2　結(jié)果與討論

2.1　XRD

圖1樣品的XRD

圖1（a）是作為對比的立方體氧化亞銅XRD圖[10]，從圖1（a）中可以看出，立方體氧化亞銅在衍射角2θ為 29.65°、36.54°、42.42°、61.58°、73.70°處有強(qiáng)吸收峰，對應(yīng)晶面指數(shù)分別為（110）（111）（200）（220）和（311）。圖1（b）是合成的氧化亞銅XRD圖，由圖1（b）可以看出，通過化學(xué)沉淀法在0.5mol/L NaOH濃度下合成的氧化亞銅在衍射角 2θ 為 29.70°、36.62°、42.52°、61.56°和73.80°處有衍射峰，對應(yīng)晶面指數(shù)分別為（110）（111）（200）（220）和（311），與標(biāo)準(zhǔn)譜庫氧化亞銅譜圖（JCPDS05-667）一致，未出現(xiàn)銅或氧化銅的雜質(zhì)峰，說明制得的氧化亞銅較純。

2.2　FE-SEM

圖2（a）是作為對比的立方體氧化亞銅掃描電鏡圖[10]，合成的氧化亞銅的掃描電鏡如圖2（b）所示。由圖2（b）可知，在0.5mol/L NaOH濃度下合成的氧化亞銅呈花簇狀，粒徑約200nm；立方體氧化亞銅粒徑約500nm。

圖2　氧化亞銅的FE-SEM

2.3　BET分析

花簇狀氧化亞銅和立方體氧化亞銅的比表面積如表1所示。通過對比可知，花簇狀氧化亞銅的比表面積比立方體氧化亞銅的大。

2.4　抑菌性

表1　花簇狀氧化亞銅和立方體氧化亞銅的比表面積

首先采用平板菌落計(jì)數(shù)法來考查兩種氧化亞銅樣品的抑菌性能。取2mg氧化亞銅配制各自的樣品培養(yǎng)基，滅菌后分別涂布大腸桿菌，培養(yǎng)24h后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，圖（c）中的菌落數(shù)比圖（b）中少，即比表面積大的花簇狀氧化亞銅的抑菌性能比立方體氧化亞銅的抑菌性能好。

為了更加深入地考查樣品抑菌過程，探究其抑菌機(jī)制，本文又采用振蕩接觸法，通過將兩組樣品與細(xì)菌接觸不同時(shí)間來觀察其抑菌效果。

圖4是兩種氧化亞銅樣品分別和大腸桿菌溶液接觸 10、20 和 30min 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖 4（a1）和圖 4（b1）可以看出，大腸桿菌和樣品接觸10min時(shí)，圖4（b1）的菌落數(shù)目較少，即花簇狀氧化亞銅的抑菌效果比較好。我們知道二價(jià)銅離子也是有抑菌作用的[13]，但是氧化亞銅釋放銅離子需要一個(gè)過程，10min時(shí)間很短，這時(shí)氧化亞銅抑菌應(yīng)該主要是氧化亞銅本身的抑菌作用，因此氧化亞銅是直接接觸抑菌機(jī)制，同時(shí)也說明在短時(shí)間的接觸中花簇狀氧化亞銅的抑菌性能優(yōu)于立方體氧化亞銅。

從圖 4（a2）和圖 4（b2）可以看出，時(shí)間延長到 20 min時(shí)，與立方體氧化亞銅接觸的大腸桿菌菌落數(shù)目大量減少，并且兩種氧化亞銅樣品培養(yǎng)基上存活的菌落數(shù)目接近，花簇狀氧化亞銅的優(yōu)勢不再明顯。分析原因可能是花簇狀氧化亞銅的比表面積比立方體氧化亞銅的比表面積大很多，當(dāng)樣品和大腸桿菌接觸時(shí)間較短（10 min），立方體氧化亞銅的比表面積小，和大腸桿菌接觸不充分；而在20min時(shí)由于時(shí)間延長，立方體氧化亞銅得以和大腸桿菌充分接觸，所以抑菌效果提高，與花簇狀氧化亞銅相當(dāng)。從圖4（a3）和圖4（b3）可以看出，在大腸桿菌和樣品接觸30min時(shí)，兩個(gè)培養(yǎng)基上均無菌落生長。由此可見，適量的氧化亞銅和細(xì)菌接觸足夠的時(shí)間都可以把細(xì)菌全部殺死。綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程來看，氧化亞銅是直接接觸抑菌機(jī)制，比表面積大的氧化亞銅的抑菌性能好，這種優(yōu)勢在較短的接觸時(shí)間內(nèi)尤其明顯。

3　結(jié)論

采用化學(xué)沉淀法制備了粒徑約200nm、比表面積為7.764m2/g的花簇狀氧化亞銅，通過平板菌落計(jì)數(shù)法和振蕩接觸法將其與立方體氧化亞銅進(jìn)行對比，探究了比表面積對氧化亞銅抑菌性的影響并探討了氧化亞銅的抑菌機(jī)制。結(jié)果表明，與細(xì)菌短時(shí)間接觸中比表面積大的氧化亞銅抑菌性好，氧化亞銅是直接接觸抑菌機(jī)制。

[1]顧修全，王波，陳凡，等.氧化亞銅在太陽能電池、光催化領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工，2012，32（2）：19-22.

[2]Zhang J.，Liu J.，Peng Q.，et al.Nearly Monodisperse Cu2O and CuO Nanospheres:Preparation and Applications for Sensitive Gas Sensors[J].ChemistryofMaterials，2006，18（4）：867-871.

[3]馬振青.氧化石墨烯/氧化亞銅納米復(fù)合材料的制備及其抑菌性研究[D].中國海洋大學(xué)，2014.

[4]de Jongh P.E.，Vanmaekelbergh D.，Kelly J.J.Cu2O：a Catalyst for thePhotochemicalDecompositionofWater?[J].Chemical Communications，1999：1069-1070.

[5]PangH.，GaoF.，Lu Q.MorphologyEffect on Antibacterial Activity ofCuprous Oxide[J].Chemical Communications，2009：1076-1078.

[6]Lee Y.J.， Kim S.， Park S.H.， et al.Morphology-dependent Antibacterial Activities of Cu2O[J].Materials Letters，2011，65（5）：818-820.

[7]Jung H.Y.， Seo Y.， Park H.， et al.Morphology-controlled SynthesisofOctahedral-to-rhombicDodecahedralCu2O Microcrystals and Shape-dependent Antibacterial Activities[J].Bulletin ofthe Korean Chemical Society，2015，36（7）：1828-1833.

[8]Ren J.，Wang W.，Sun S.，et al.Crystallography Facet-dependent Antibacterial Activity：the Case of Cu2O[J].Industrial&EngineeringChemistryResearch，2011，50（17）：10366-10369.

[9]宋繼梅，張蕙，王紅，等.氫氧根輔助氧化亞銅的形貌控制合成及其性質(zhì)研究 [J].安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，36（1）：18-25.

[10]Li N.，Yang B.J.，Xu L.C，et al.Simple Synthesis of Cu2O/Na-bentoniteCompositesandTheirExcellentPhotocatalytic Properties in Treating Methyl Orange Solution[J].Ceramics International，2016，42：5979-5984.

[11]蔡信之，黃君紅.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[12]張明慧.納米氧化亞銅及其復(fù)配物的制備和抗菌性研究[D].浙江理工大學(xué)，2015.

[13]SinghR.K.， KannanS.Synthesis， StructuralAnalysis，Mechanical，Antibacterial and Hemolytic Activity of Mg2+and Cu2+Co-substitutionsin β-Ca3（PO4）2[J].Materials Science and Engineering：C，2014，45：530-538.□