盛鳳，張春艷，閆玉蘭，李麗麗,3，劉曉智,3，吳問(wèn)漢

1天津市第五中心醫(yī)院，天津300450；2天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院；3天津市早產(chǎn)兒器官發(fā)育表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4北京大學(xué)第一醫(yī)院

肝母細(xì)胞瘤是兒童惡性肝腫瘤中最常見(jiàn)的一種，約占80%[1]。手術(shù)切除是肝母細(xì)胞瘤治療的基礎(chǔ)，但大多數(shù)患兒在診斷時(shí)因肝臟占位大，無(wú)法達(dá)到根治性手術(shù)切除；而且肝母細(xì)胞瘤自身對(duì)放療和化療均不敏感，致使其預(yù)后不良[2]。因此，尋找新的救治手段或開(kāi)發(fā)新的藥物，提高靶向治療效果，改善患者預(yù)后，是當(dāng)前肝母細(xì)胞瘤治療的主要任務(wù)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤成因多為瘀毒、痰凝、氣血壅滯、飲食勞倦、人體正氣虧損等。有專(zhuān)家認(rèn)為，正氣內(nèi)虛是腫瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因，寒乃生積與不溫不散是中醫(yī)藥治療腫瘤的新思路，而溫陽(yáng)法貫穿腫瘤治療的始終[3～6]。目前已證實(shí)，溫陽(yáng)散寒湯藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[7～10]。為了進(jìn)一步探析和驗(yàn)證溫陽(yáng)藥物對(duì)肝母細(xì)胞瘤的療效及作用機(jī)制，2018年1月～2019年5月，本課題組選用經(jīng)典溫陽(yáng)方——四逆湯，觀察其對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，探討其潛在的作用機(jī)制，為溫陽(yáng)散寒湯藥治療肝母細(xì)胞瘤提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 四逆湯所含中藥由天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)科提供；人肝母細(xì)胞瘤株Hep G2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、蛋白激酶B1(AKT-1)及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；MTT試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.2 四逆湯水煎液的制備 參照2015版《中國(guó)藥典》，(制)附子∶干姜∶炙甘草=3∶2∶3，按處方7日量稱(chēng)取藥物，加入12倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱過(guò)濾，藥渣再加10倍量水，煎煮30 min，合并2次濾液，濃縮至1 g/mL。于4 ℃下，14 000 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，在無(wú)菌條件下用0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得四逆湯水煎液[11]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物干預(yù) Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，飽和濕度。每3～4天按1∶3比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。將貼壁過(guò)夜的Hep G2細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組用等體積的PBS溶液繼續(xù)培養(yǎng)，四逆湯組用終濃度為50 mg/mL的四逆湯繼續(xù)培養(yǎng)[4]，均培養(yǎng)48 h。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2細(xì)胞，用含0.25% EDTA的胰酶消化后以1×104個(gè)細(xì)胞/孔均勻接種在96孔板內(nèi)，過(guò)夜貼壁，用DMEM/高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓5 h。然后將其按以上分組方式加入PBS、四逆湯分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，于酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將Hep G2細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)95%以上時(shí)，用10 μL無(wú)菌槍頭在6孔板垂直劃線(xiàn)，PBS洗去脫落細(xì)胞記錄初始劃痕寬度(S0)。隨后按1.3分組處理細(xì)胞，待96 h后終止實(shí)驗(yàn)并記錄劃痕寬度，記作S1，(S0-S1)/S0×100%即為細(xì)胞遷移率。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將Matrigel膠放置4 ℃冰箱過(guò)夜至溶解，并用DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋后取100 μL加入Transwell小室上室，于37 ℃溫育使膠凝固。胰酶消化Hep G2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至2×105個(gè)/L，取細(xì)胞懸液200 μL接種至上室，然后按1.3分組處理細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，24 h后取出Transwell上室，擦去小室上層細(xì)胞，以蘇木素進(jìn)行細(xì)胞染色，計(jì)數(shù)進(jìn)入Transwell小孔的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其百分比。

1.7 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。按1.3分組處理細(xì)胞，用無(wú)EDTA的胰酶消化結(jié)合機(jī)械性吹吸獲得單細(xì)胞懸液(30 000個(gè)細(xì)胞)，經(jīng)漂洗、固定后送檢。用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)各組凋亡細(xì)胞，并計(jì)算凋亡率。以上由國(guó)家納米技術(shù)與工程研究院協(xié)助完成。

1.8 細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、AKT-1及PGC-1α蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。按1.3分組處理細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞后加入適量蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)的濃度，然后經(jīng)制膠(SDS-PAGE膠)、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL顯影、成像等步驟，檢測(cè)HIF-1α、AKT-1和PGC-1α的表達(dá)量。以Actin為內(nèi)參。各蛋白與內(nèi)參的灰度值比值即為其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 四逆湯對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖的影響 對(duì)照組Hep G2細(xì)胞增殖率為(62.25±5.67)%，四逆湯組為(35.50±2.96)%。與對(duì)照組比較，四逆湯組Hep G2細(xì)胞增殖率低(P<0.05)。

2.2 四逆湯對(duì)Hep G2細(xì)胞遷移能力的影響 干預(yù)96 h，對(duì)照組細(xì)胞遷移距離為(57.41±4.97)μm，四逆湯組為(23.59±4.04)μm。與對(duì)照組比較，四逆湯組細(xì)胞遷移距離短(P<0.05)。

2.3 四逆湯對(duì)Hep G2細(xì)胞侵襲能力的影響 對(duì)照組向Transwell下室遷移的細(xì)胞比例為(37.25±4.91)%，四逆湯組為(18.55±4.25)%。與對(duì)照組比較，四逆湯組向Transwell下室遷移的細(xì)胞比例低(P<0.05)。

2.4 四逆湯對(duì)Hep G2細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(4.23±0.74)%，四逆湯組為(21.59±4.03)%。與對(duì)照組比較，四逆湯組細(xì)胞凋亡率高(P<0.05)。

2.5 四逆湯對(duì)Hep G2細(xì)胞HIF-1α、AKT-1、PGC-1α蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組HIF-1α、AKT-1、PGC-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.68±0.08、1.40±0.05、1.41±0.03，四逆湯組分別為1.01±0.03、0.88±0.02和0.79±0.03。與對(duì)照組比較，四逆湯組HIF-1α、AKT-1、PGC-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量低(P均<0.05)。

3 討論

四逆湯是回陽(yáng)救逆的代表方劑，方用生附子為君，溫壯命火，破陰逐寒，通行十二經(jīng)脈；干姜辛熱，守而不走，溫中散寒，助附子破陰回陽(yáng)，為臣藥；炙甘草辛甘溫?zé)?，扶?yáng)益氣，甘緩峻烈以護(hù)陰液，更有持續(xù)藥力以防虛陽(yáng)脫散之用。三藥配合，相須相使，共同發(fā)揮溫中散寒，回陽(yáng)救逆的功效。腫瘤是細(xì)胞增殖、分化、凋亡異常的疾病，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也是治療的難點(diǎn)。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)四逆湯能夠有效抑制Hep G2細(xì)胞增殖，同時(shí)能降低Hep G2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明，四逆湯可有效抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

四逆湯抑制肝母細(xì)胞瘤惡性生物學(xué)行為的機(jī)制尚不清楚。為此，課題組通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究[12，13]表明，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管形成等過(guò)程中均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。AKT是PI3K下游極為重要的效應(yīng)分子，也是一種抗凋亡調(diào)節(jié)因子。作為癌變責(zé)任基因，AKT-1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。肝癌作為絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤之一，其中存在著缺氧微環(huán)境，且HIF均呈高表達(dá)[14，15]。而HIF可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管生成，細(xì)胞能量代謝等相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。此外，PGC-1α是線(xiàn)粒體生物合成最重要的調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)線(xiàn)粒體功能、增強(qiáng)呼吸能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。本研究檢測(cè)了以上三個(gè)具有代表性癌變責(zé)任蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四逆湯能夠明顯降低HIF-1α、AKT-1和PGC-1α蛋白表達(dá)。由此推測(cè)，四逆湯對(duì)肝母細(xì)胞瘤的抑制作用與HIF-1α、AKT-1和PGC-1α相關(guān)通路的作用相關(guān)，但具體的作用機(jī)制仍未闡明。相關(guān)研究[17～20]表明，本研究選取的三個(gè)較具代表性的癌變責(zé)任基因HIF-1α、AKT-1和PGC-1α均可以被小泛素相關(guān)蛋白SUMO化修飾。四逆湯對(duì)肝母細(xì)胞瘤的抑制作用是否通過(guò)以上三個(gè)癌變責(zé)任蛋白的SUMO化修飾產(chǎn)生的聯(lián)系引起，仍需后期深入研究。