劉穎，喬如麗，尚里，張鋒軍，焦揚(yáng)馳，胡思暢，趙慶麗

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院，蘭州 730050

乳腺癌是女性中發(fā)病率和病死率都最高的一種惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性身心健康[1]。癌癥是多種內(nèi)外因素不協(xié)調(diào)相互作用導(dǎo)致的結(jié)果，其中低氧微環(huán)境既可促進(jìn)癌癥的發(fā)展，也是癌細(xì)胞增殖過程中導(dǎo)致的結(jié)果之一[2]。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(Ets)家族可編碼一大類轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子共享一個(gè)高度保守由85個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(Ets結(jié)構(gòu)域)。Ets家族轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控多種參與癌癥發(fā)生和進(jìn)展的基因表達(dá)[3]。多項(xiàng)研究[4,5]證實(shí)，Ets家族成員E26轉(zhuǎn)錄特異性序列-1(Ets-1)在乳腺癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其可通過增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及抗藥性等特性促進(jìn)癌癥的發(fā)展。目前，已確定的Ets的下游目的基因包括參與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基質(zhì)降解蛋白酶，如尿激酶和MMP-1、MMP-3、MMP-9等，均已在包括乳腺癌的多種癌癥中反復(fù)得到驗(yàn)證[6～8]。在二級(jí)浸潤性乳腺導(dǎo)管癌中，癌組織Ets表達(dá)明顯高于癌旁組織。低氧微環(huán)境是乳腺癌的重要特點(diǎn)，低氧環(huán)境誘導(dǎo)Ets-1和Ets-2在MCF-7、SKBR3、BT20、BT474、MDAMB468等多種乳腺癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)[9,10]。文獻(xiàn)[9,11]報(bào)道，低氧環(huán)境與Ets-2在MCF-7乳腺癌細(xì)胞、多囊卵巢綜合征中的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。但是目前關(guān)于Ets-1在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高水平的機(jī)制尚不明確。2018年10月～2019年12月，我們觀察了低氧環(huán)境下人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 Ets-1表達(dá)變化，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(Gibco公司)；DMEM-高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Life科技公司，青霉素以及鏈霉素(雙抗)、胰蛋白酶購自Hyclone公司，RIPA裂解液購自北京索萊寶科技公司，Triton-100購自北京益利精細(xì)化學(xué)品公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自Sigma公司，蛋白酶體抑制劑MG132、p300和抑制劑C646均購自美國Selleck公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher公司。缺氧小室購自Stemcell公司，垂直電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(TRANS-BlotR SD)購自美國BIO-Rad公司，低溫離心機(jī)(EPENDORF centrifuge 5417R)購自德國EPendorf公司，蛋白凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(RT-PCR 7500)購自美國ABI公司。

1.2 低氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ets-1蛋白檢測(cè) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7培養(yǎng)于含10%FBS以及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，常氧培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、20%O2。本研究用兩種方法創(chuàng)造低氧環(huán)境，即CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)性低氧培養(yǎng)環(huán)境和厭氧培養(yǎng)箱物理性低氧培養(yǎng)環(huán)境。①CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)性低氧培養(yǎng)環(huán)境：取常氧培養(yǎng)條件下生長良好的對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞，分成4組，同時(shí)分別放入用0、100、200、400 μmol/L的氯化鈷(CoCl2)化學(xué)誘導(dǎo)的低氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h(分別計(jì)為0、100、200、400 μmol/L CoCl2組)。采用Western blot法檢測(cè)Ets-1蛋白：取生長密度至80%左右MCF-7細(xì)胞，用胰酶消化各組細(xì)胞，PBS清洗兩遍。使用200 μL的RIPA裂解液提取蛋白，冰上裂解30 min。使用4 ℃離心機(jī)，以13 000 r/min離心15 min，小心收集上清。使用BCA法測(cè)量蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制適宜濃度的SDS-PAGE7.5%分離膠。濃縮膠中以80 V電壓，分離膠中以120 V電壓進(jìn)行電泳；使用PVDF膜并預(yù)活化30 min，0.3A轉(zhuǎn)膜2.5 h，不同分子量大小的大白適當(dāng)縮短或延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間；室溫下，根據(jù)抗體說明書，用5%的脫脂牛奶或5%BSA封閉1 h；加入一抗(各抗體使用濃度見表1)4 ℃孵育過夜；次日，在搖床上使用TBST洗滌10 min，3次；加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h；再次使用TBST洗滌10 min，3次；采用lab image軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。②厭氧培養(yǎng)箱給予的低氧培養(yǎng)環(huán)境：取生長良好的對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞，將細(xì)胞分別置于缺氧小室和常氧小室(分別計(jì)為缺氧1組和常氧1組)，維持在37 ℃、5%CO2、1%O2或20%O2、94%N2的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)24 h。后采用Western blot法檢測(cè)Ets-1蛋白，具體步驟參照“①”。所有細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，每48 h根據(jù)細(xì)胞生長狀況更換一次培養(yǎng)基。

1.3 低氧和常氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ets-1 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè)。取正常條件下培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞，分別放入1%O2和20%O2的環(huán)境中培養(yǎng)(分別計(jì)為缺氧2組和常氧2組)，其他條件都相同并適合細(xì)胞的生長。培養(yǎng)24 h后用TRIzol法分別提取細(xì)胞總RNA。使用5×All-In-One RT MaterMix(APlied Biological Materials)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA可儲(chǔ)存于-20 ℃，或直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用SYBRGreen實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Thermo Scientific)完成定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置三個(gè)副孔。q-PCR以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 低氧和常氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞過表達(dá)或敲降HIF-1α基因后Ets-1蛋白檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)接種于兩塊6孔板中，放置于5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度接近60%時(shí)分為兩組，正常氧氣量培養(yǎng)組在20%O2正常氧氣量環(huán)境下培養(yǎng)，低氧氣量培養(yǎng)組在1%O2低氧氣量環(huán)境下培養(yǎng)。正常氧氣量培養(yǎng)組又分為3組，轉(zhuǎn)染His-HIF-1α過表達(dá)組轉(zhuǎn)染過表達(dá)His-HIF-1α，蛋白酶抑制劑MG132組加入蛋白酶抑制劑MG132，對(duì)照組不予處理；低氧氣量培養(yǎng)組又分為3組，轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA敲降組轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA，p300抑制劑C646組加入p300抑制劑，對(duì)照組不予處理。其中轉(zhuǎn)染His-HIF-1α過表達(dá)組和轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA空載組均采用慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后更換新鮮培養(yǎng)基，以上兩組均加入2 μg/mL的puro，篩選具有抗性的細(xì)胞。取上面6組中的細(xì)胞，采用Western blot法檢測(cè)Ets-1蛋白，從總體上了解過表達(dá)或敲降HIF-1α基因及加入相關(guān)抑制劑MG132和C646對(duì)Ets-1蛋白表達(dá)的影響，初步探索影響Ets-1的機(jī)制。方法參照 “1.2的①”。

1.5 低氧和常氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ace-K、p300、COP-1、His-tag、p-S/T蛋白檢測(cè) ①COP-1蛋白：取正常條件下培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，分兩組，分別放入低氧(1%O2)和常氧(20%O2)的環(huán)境中培養(yǎng)。用IgG做陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，采用預(yù)冷的PBS清洗兩遍并收集細(xì)胞。在收集的細(xì)胞中加入IP buffer[50 mmol/L Tris，1%Triton X-100，10%(v/v)甘油，150 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1%蛋白酶抑制劑，10 mmol/L EDTA，pH 7.5]，冰上裂解30 min。4 ℃，以13 000 r/min速度離心10 min，收集上清，加入適量免疫磁珠和相應(yīng)的IP抗體(處理組：Ets-1抗體和E3泛素連接酶COP-1抗體)或等量同種IgG抗體(陰性對(duì)照)，4 ℃翻轉(zhuǎn)孵育過夜。次日，將抗體-抗原-磁珠復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，使用Wash buffer(50 mmol/L Tris，1%Triton X-100，150 mmol/L NaCl)洗滌3次，加入適量上樣緩沖，液煮沸5 min，收集樣品，-80 ℃ 保存或直接進(jìn)行后續(xù)研究。用Western blot檢測(cè)蛋白共沉淀情況。②Ace-K蛋白：Ace-K蛋白是乙?；闹匾鞍祝瑱z測(cè)Ace-K蛋白與Ets-1蛋白的共沉淀作用能證明Ets-1是否發(fā)生乙?；?。取正常條件下培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，分兩組，分別放入低氧(1%O2)和常氧(20%O2)環(huán)境中培養(yǎng)。用IgG做陰性對(duì)照。具體步驟參照“1.5的①”。③p300蛋白和p-S/T蛋白：取在低氧(1%O2)條件下培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，用轉(zhuǎn)染Vector并用IgG做試驗(yàn)的陰性對(duì)照，試驗(yàn)分為兩組，一組為轉(zhuǎn)染His-HIF-1α過表達(dá)序列和脂質(zhì)體LipofectamineTM3000，一組為轉(zhuǎn)入Vector陰性對(duì)照序列和脂質(zhì)體LipofectamineTM3000的陰性對(duì)照組。用組氨酸標(biāo)簽(His-tag)做為純化標(biāo)記，采用“1.5的①”共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)以上3組的p-300蛋白。④COP-1、Ets-1蛋白：取低氧(1%O2)條件下培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，加入DMSO并用IgG做試驗(yàn)的陰性對(duì)照，試驗(yàn)分為兩組，一組加入DMSO做陰性對(duì)照，一組加入用DMSO配置的C646溶液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行IP試驗(yàn)。具體步驟參照“1.5的①”。

1.6 低氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ets-1、p-300蛋白檢測(cè) 采用細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)。取低氧環(huán)境下培養(yǎng)了24 h的MCF-7細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液，密度為5×104/mL，將無菌爬片放置于24孔板中，加入細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后進(jìn)行免疫熒光染色。首先使用干凈預(yù)冷的PBS洗3次，加入4%的多聚甲醛室溫固定20min，然后置于搖床上用PBS清洗3次，每次3 min。滴加0.3%Triton穿孔處理20 min，再次用PBS清洗3次。1%BSA封閉1h后，滴加一抗，孵育過夜。次日，用PBS清洗3次，加二抗，室溫孵育1h，注意避光。然后，PBS清洗3次，用DAPI染色5 min，PBS徹底清洗3次，10 min/次。最后，用防熒光猝滅劑封片。干燥，避光4 ℃保存。待玻片干燥，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 低氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 0、100、200、400 μmol/L CoCl2組Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是0.87、1.15、1.43、1.62，后3組與第1組比較，P均<0.05。常氧1組和缺氧1組Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是0.11、0.74，兩組比較，P<0.05。

2.2 低氧和常氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 低氧2組及常氧2組Ets-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.002 7、0.001 8，兩組比較，P<0.05。

2.3 低氧和常氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞過表達(dá)或敲降HIF-1α基因后Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 常氧條件下，對(duì)照組、轉(zhuǎn)染His-HIF-1α過表達(dá)HIF-1α組、加入MG132組的Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是0.14、0.81和0.84，過表達(dá)HIF-1α組、加入MG132組分別與對(duì)照組比較，P均<0.05。在低氧環(huán)境下，對(duì)照組、siRNA敲降HIF-1α組、加入C646組的Ets-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.86、0.83、0.86，兩兩比較，P均>0.05。

2.4 低氧和常氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ace-K、p300、COP-1、His-tag、p-S/T蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 ①Co-IP試驗(yàn)檢測(cè)了常氧條件(20%O2)和低氧環(huán)境(1%O2)刺激下，Ets-1與E3泛素連接酶COP-1的相互作用，結(jié)果顯示低氧環(huán)境干擾了Ets-1的降解途徑，Ets-1與COP-1存在共沉淀現(xiàn)象，并且低氧環(huán)境影響了共沉淀情況。②乙?；治鼋Y(jié)果顯示，低氧引起的Ets-1乙酰化水平升高并干擾Ets-1的泛素化修飾。低氧刺激(1%O2)下MCF-7細(xì)胞Ets-1乙?；礁哂诔Ｑ?20%O2)條件下的Ets-1。常氧組和低氧組都發(fā)生了Ets-1與Ace-K共沉淀的現(xiàn)象，20%O2組的Ets-1的表達(dá)水平相較于1%O2組有明顯升高。乙?；腅ts-1蛋白泛素化降解可能受到競爭性抑制，進(jìn)而影響低氧環(huán)境下Ets-1的表達(dá)水平。③低氧環(huán)境通過p300增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞中Ets-1的乙酰化水平。過表達(dá)HIF-1α?xí)r，乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300蛋白水平相對(duì)于vector陰性對(duì)照組無顯著改變，但其磷酸化水平顯著升高，p-S/T的表達(dá)水平相對(duì)于vector組顯著升高，提示了乙?；D(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)。④使用p300抑制劑C646處理生存于低氧環(huán)境的MCF-7細(xì)胞，Ets-1蛋白表達(dá)相較于DMSO對(duì)照組無明顯變化，但Ets-1與COP-1互作相對(duì)加強(qiáng)，共沉淀效果加強(qiáng)，說明二者相互作用增強(qiáng)依賴于p300活性的減弱。而C646作用后的MCF-7細(xì)胞中Ets-1的表達(dá)水平相對(duì)于DMSO對(duì)照組顯著降低。因此，低氧環(huán)境通過活化的P300蛋白調(diào)節(jié)Ets-1的乙?；乃接绊慐ts-1的泛素化降解。

2.5 低氧環(huán)境下MCF-7細(xì)胞Ets-1、p-300蛋白免疫熒光染色結(jié)果 低氧環(huán)境(1%O2)下p300蛋白和Ets-1蛋白在MCF-7細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生了共表達(dá)和共定位。

3 討論

乳腺癌嚴(yán)重威脅女性健康，以每年17 000 000新發(fā)病例的速度在增長[12,13]。近年來，雖然乳腺癌患者可以選擇多種新的治療方案，但伴有腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的患者平均生存率僅為2 %。有研究預(yù)測(cè)發(fā)展中國家未來20年內(nèi)乳腺癌發(fā)病率和病死率將增加55%、58%[14]。低氧環(huán)境是腫瘤的重要特征，25%～40%的侵襲性乳腺癌展現(xiàn)出低氧區(qū)域。采用polarographic electrodes策略檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織平均氧分壓為(14.1±0.3) mmHg，而腫瘤組織中氧分壓僅為(10.3±0.4) mmHg[15,16]。研究[9,10]表明，Ets轉(zhuǎn)錄因子在乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，且與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是，Ets在乳腺癌中的高表達(dá)的機(jī)制及與低氧微環(huán)境的關(guān)系尚不清楚。

Ets轉(zhuǎn)錄因子超家族是細(xì)胞內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，其受多種細(xì)胞外刺激和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在胚胎發(fā)育過程中，MAPK通過招募共激活因子CREB和p300磷酸化Ets-1、Ets-2，該過程在正常發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。研究[18]表明，在多種惡性腫瘤的進(jìn)展過程中，Ets家族蛋白異常高表達(dá)，提示該家族轉(zhuǎn)錄因子在癌癥發(fā)展中起重要作用。同時(shí)癌細(xì)胞增殖過程中，隨著細(xì)胞的增多，營養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)減少，氧消耗量也顯著增多，造成缺氧的腫瘤微環(huán)境，癌細(xì)胞可通過激活相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)癌基因表達(dá)，發(fā)展出適應(yīng)低氧微環(huán)境的機(jī)制。研究[18]發(fā)現(xiàn)，HIF可促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)和促紅細(xì)胞生成素基因的表達(dá)。在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中，除了經(jīng)典的目的基因之外，Ets-1也可通過調(diào)控VEGF受體和血管生成素2的表達(dá)而促進(jìn)癌組織中血管的生成[19,20]。HIF與Ets-1之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系。Oikawa等在膀胱癌T24細(xì)胞系中研究發(fā)現(xiàn)，位于Ets-1啟動(dòng)子上游-424到-279 bp序列為低氧應(yīng)答元件樣序列(HRE)，在低氧環(huán)境下，HIF-1α可以與之結(jié)合并促進(jìn)Ets-1的表達(dá)[21]。以上研究結(jié)果提示我們，Ets-1的表達(dá)水平有可能受HIF-1α調(diào)控。而且，HIF-1α是低氧環(huán)境下重要的細(xì)胞因子，其在乳腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，暗示低氧環(huán)境HIF-1α可能調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中Ets-1的高表達(dá)。

本研究旨在探究乳腺癌細(xì)胞系中低氧微環(huán)境調(diào)節(jié)Ets-1高表達(dá)的分子機(jī)制。通過q-PCR實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了在乳腺癌細(xì)胞中低氧刺激可促進(jìn)Ets-1 mRNA水平的表達(dá)，即低氧環(huán)境增加了Ets-1蛋白的來源。這與Oikawa等在膀胱癌細(xì)胞系中的研究結(jié)果一致。為了盡可能全面的闡釋低氧微環(huán)境導(dǎo)致Ets-1蛋白在乳腺癌細(xì)胞系中升高的機(jī)制，我們從Ets-1蛋白降解的角度進(jìn)行了研究。Ets-1蛋白經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。Ets-1可在賴氨酸(Lysine,K)位點(diǎn)上接受多修飾系統(tǒng)直接被調(diào)控，如小泛素樣修飾(SUMO)系統(tǒng)，COP-1介導(dǎo)的K-48多聚泛素鏈修飾，以及乙?；揎椀?。而且，不同的翻譯后修飾相互競爭，形成一種高效且可逆的調(diào)節(jié)方式，無需冗雜的蛋白從頭合成，使細(xì)胞能夠?qū)ν饨绛h(huán)境作出迅速靈敏的反應(yīng)[22]。SUMO修飾往往不改變Ets-1蛋白穩(wěn)定性，更多是在其轉(zhuǎn)錄活性方面起調(diào)節(jié)作用[12]。因此我們推斷，低氧刺激下，Ets-1乙?；缴?，阻礙了COP-1的識(shí)別，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白在細(xì)胞質(zhì)積聚。乙?；治鲵?yàn)證了這一推斷，在低氧培養(yǎng)條件下，Ets-1乙?；斤@著升高，并且Ets-1與COP-1互作也被削弱。

p300是真核生物中最重要的乙?；D(zhuǎn)移酶之一，其活性接受磷酸化/去磷酸化調(diào)控[15]。之前研究表明，過表達(dá)HIF-1α后，p300磷酸化水平顯著升高。但對(duì)HIF-1α調(diào)控p300磷酸化的機(jī)制，尚未進(jìn)行深入的探索。有文章報(bào)道，低氧環(huán)境下，MAPK等信號(hào)通路異?；罨珽RK/MAPK可使p300磷酸化，酶活性增強(qiáng)，我們推測(cè)這可能是有效的分子機(jī)制之一。但是，由于p300蛋白分子量偏大，多次Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不理想，因此我們使用細(xì)胞免疫熒光染色的方法較直觀得提供了二者在空間上可能互作的信息，但依然缺乏更為精確的證據(jù)。隨后，我們使用p300抑制劑C646處理培養(yǎng)于低氧環(huán)境中的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，Ets-1蛋白水平降低，并且Ets-1和COP-1的相互作用顯著增強(qiáng)，這也進(jìn)一步證實(shí)了p300在Ets-1穩(wěn)定性調(diào)節(jié)中的重要性。

總之，低氧環(huán)境在乳腺癌細(xì)胞系中促進(jìn)Ets-1的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)其泛素化降解；機(jī)制可能是低氧環(huán)境中的HIF-1α引起乙?；D(zhuǎn)移酶p300活性增強(qiáng)，促進(jìn)Ets-1發(fā)生乙?；?，這阻礙了COP-1對(duì)Ets-1的識(shí)別及后續(xù)的泛素化降解，造成Ets-1細(xì)胞內(nèi)水平增加。