黃欽欽，田亞平

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

糖尿病是一組以高血糖為特征的非傳染性慢性疾病，一般將空腹血糖大于7.0 mmol/L或餐后血糖大于11.1 mmol/L認(rèn)定為糖尿病[1]。糖尿病常伴有糖尿病腎?。I衰）、眼病（失明）、足病（截肢）、敗血癥等并發(fā)癥，幾乎危害到身體的每個部分，是致殘致死的“頭號殺手”[2-4]。II型糖尿病是糖尿病的主要類型，占糖尿病發(fā)病率的90%～95%[5]。II型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素抵抗或者是β細(xì)胞功能受損[6]。

α-葡萄糖苷酶被認(rèn)為是控制II型糖尿病的有效靶點，α-葡萄糖苷酶抑制劑通過可逆性占據(jù)α-葡萄糖苷酶的催化位點，延緩多糖向可吸收的單糖的轉(zhuǎn)化，改善餐后高血糖的出現(xiàn)，使患者的血糖保持平穩(wěn)，預(yù)防治療II型糖尿病[7]。 同時，二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPPIV）也可作為治療II型糖尿病的重要靶點[8]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）是一種經(jīng)食物刺激后由腸L細(xì)胞分泌，并能刺激胰島素分泌的激素[9]。GLP-1以葡萄糖濃度依賴的方式促進(jìn)胰島素的分泌，降低胰高血糖素的分泌，從而降低血糖。然而，GLP-1的半衰期極其短暫僅2 min，易被人體內(nèi)的DPP-IV 降解[10]。通過開發(fā)DPP-IV抑制劑，抑制DPP-IV的活性，避免GLP-1被其降解而失活，使GLP-1發(fā)揮作用，維持糖尿病患者血糖穩(wěn)定。

條斑紫菜為海洋藻類，屬紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜科、紫菜屬[11]。紫菜蛋白多肽具有降血壓[12]、抗氧化[13]、 降血脂[14]、抗凝血[15]、抑菌[16]等多種生理活性。有關(guān)紫菜蛋白降血糖活性的研究，Admassu等[17]發(fā)現(xiàn)紫菜酶解多肽體外具有α-淀粉酶抑制活性，電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（electrospray ionization-quadrupole-time of flightmass spectrometry，ESI-Q-TOF-MS）鑒定新型肽為Gly-Gly-Ser-Lys和Glu-Leu-Ser。馮學(xué)珍等[18]研究發(fā)現(xiàn)食用海藻（海帶、裙帶菜、紫菜）具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。然而，有關(guān)紫菜蛋白酶解液α-葡萄糖苷酶、DPP-IV雙酶抑制活性尚鮮有報道。

本實驗室前期通過酶解條斑紫菜證明其蛋白酶解液具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[19-20]。在此基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)條斑紫菜酶解多肽溶液同時具備DPP-IV 抑制活性。本研究對條斑紫菜α-葡萄糖苷酶、DPP-IV雙酶抑制活性肽進(jìn)行分離純化，對抑制活性高的成分進(jìn)行鑒定及活性表征，以期為紫菜資源深度開發(fā)高附加值醫(yī)藥中間體提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜 南通千鶴食品有限公司；α-葡萄糖苷酶、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（p-nitrophenyl α-Dglucopyranoside，pNPG） 上海源葉生物科技有限公司； DPP-IV、甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺 美國Sigma公司；Diprotin A（Ile-Pro-Ile） 英國Abcam公司； 中性蛋白酶、堿性蛋白酶 青島吉寶生物科技有限 公司；BCA試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司； 氨肽酶 本實驗室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UF101超濾納濾裝置 上海弗立特實業(yè)有限公司；?KTA avant蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；多功能酶標(biāo)儀 鉑金埃爾默有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UH5300雙光束紫外分光光度計、高速低溫離心機(jī) 日本日立集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 條斑紫菜蛋白酶解液的制備

條斑紫菜酶解多肽制備參照周鋒[19]、胡春芹[20]等方法稍作修改。以中性蛋白酶（酶底比為8×104U/g）、堿性蛋白酶（酶底比為8×104U/g）、氨肽酶（酶底比為28 U/g）在溫度50 ℃、pH 8.5條件下復(fù)配酶解紫菜蛋白6 h，沸水浴滅酶20 min。酶解上清液經(jīng)10 kDa膜進(jìn)行超濾除去多糖等雜質(zhì)，透過液再經(jīng)1 000 Da膜進(jìn)行納濾，得到1 000 Da以下粗肽液。

1.3.2 粗肽液穩(wěn)定性表征

1.3.2.1 pH值穩(wěn)定性

每管取1 mg/mL多肽溶液10 mL，將pH值分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10，室溫下放置2 h后，測定其 α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性。α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性保持率按式（1）計算：

式中：A1為處理前抑制率；A2為經(jīng)不同pH值處理后抑制率。

1.3.2.2 溫度穩(wěn)定性

每管取1 mg/mL多肽溶液10 mL，置于100 ℃的沸水浴中，恒溫1、2、3、4、5 h后，取出冷卻至室溫，測定其α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性。按式（1）計算α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性保持率。

1.3.2.3 體外模擬胃腸消化

用2 mol/L的HCl溶液將條斑紫菜多肽溶液pH值調(diào)至2.0，放入37 ℃水浴中孵育15 min，按酶與底物比1∶40加入胃蛋白酶。避光于37 ℃、130 r/min恒溫孵育70 min（此轉(zhuǎn)速模擬體內(nèi)胃蠕動）。用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH 6.8終止胃蛋白酶反應(yīng)。將胃蛋白酶消化階段混合液37 ℃預(yù)熱15 min，按酶與底物比1∶40加入胰蛋白酶，充分溶解，避光于37 ℃、45 r/min恒溫孵育120 min，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液加熱至100 ℃持續(xù)20 min終止酶反應(yīng)。為明確消化過程對多肽樣品抑制活性的影響，分別測定胃蛋白酶、胰蛋白酶消化體系對 α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性。

1.3.3 Sephadex G-10凝膠過濾層析

將溶脹好的Sephadex G-1 0 介質(zhì)填充成14 mm×600 mm的層析柱，用去離子水進(jìn)行平衡。粗肽液經(jīng)0.22 μm濾膜除去雜質(zhì)，樣品進(jìn)樣量為1 mL，洗脫劑為去離子水，洗脫流速1 mL/min，在220 nm波長下進(jìn)行檢測。收集各洗脫峰，冷凍干燥，分別配制成0.5 mg/mL的溶液，測定其對α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制活性。

1.3.4 超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）-ESI-Q-TOF-MS分析

將凝膠過濾層析得到的抑制活性最強(qiáng)的峰收集濃縮，利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS鑒定純化肽的氨基酸序列和分子質(zhì)量大小。色譜條件：BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相A：0.1%甲酸；流動相B：0.1%甲酸-乙腈；流速0.3 mL/min；上樣量5 μL；柱溫45 ℃；檢測波長220 nm。質(zhì)譜條件：正離子模式電噴霧；母離子質(zhì)量范圍m/z 50～2 000；碰撞能量6 eV。使用MassLynx V4.1軟件進(jìn)行氨基酸序列分析。

1.3.5 合成肽雙酶抑制活性表征

經(jīng)MaxEnt3和PepSep分析鑒定得到的肽序委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純度99.69%，驗證其α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制活性。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

采用pNPG法，參照Lordan等[21]方法并稍作修改。用20 mmol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）將α-葡萄糖苷酶與pNPG分別配制成200 U/mL 和10 mmol/L的溶液。移取100 μL樣品溶液和50 μL α-葡萄糖苷酶溶液于96 孔微量滴定板中，在37 ℃水浴保溫10 min，再加入50 μL的pNPG溶液37 ℃條件下充分反應(yīng)1 h，最后加入50 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀405 nm波長處測定吸光度。實驗設(shè)置樣品組、樣品空白組、對照組、空白組。采用阿卡波糖為陽性對照，與紫菜酶解多肽對α-葡萄糖苷酶的抑制效果作對比。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（2）計算：

式中：Ac為對照組吸光度，PBS＋酶＋pNPG＋Na2CO3；Ab為空白組吸光度，PBS＋PBS＋pNPG＋Na2CO3；As為樣品組吸光度，多肽＋酶＋pNPG＋Na2CO3；An為樣品空白組吸光度，多肽＋PBS＋PBS＋Na2CO3。

1.3.7 DPP-IV抑制活性的測定

通過底物發(fā)色法，參照Wang Rongchun等[22]方法稍有改良。用100 mmol/L、pH 8.0的Tris-His緩沖液將DPP-IV 與甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺分別配制成0.02 U/mL和2.5 mmol/L的溶液。25 μL樣品溶液與25 μL甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺溶液37 ℃反應(yīng)10 min，再加入50 μL DPP-IV溶液37 ℃充分反應(yīng)1 h。最后，加入100 μL的乙酸鈉緩沖液（1 mol/L，pH 4.0）終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀405 nm波長處反應(yīng)溶液的吸光度。以Diprotin A作為陽性對照，計算如式（3）所示：

式中：Ac為對照組吸光度，Tris-His緩沖液＋甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺溶液＋DPP-IV＋乙酸鈉緩沖液；Ab為空白組吸光度，Tris-His緩沖液＋甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺溶液＋Tris-His緩沖液＋乙酸鈉緩沖液；As為樣品組吸光度，多肽＋甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺溶液＋DPPIV＋乙酸鈉緩沖液；An為樣品空白組吸光度，多肽＋Tris-His緩沖液＋Tris-His緩沖液＋乙酸鈉緩沖液。

1.3.8 多肽分子質(zhì)量分布測定

參照Li Tingting等[23]方法進(jìn)行測定。

1.3.9 多肽質(zhì)量濃度測定

采用BCA試劑盒法測定多肽質(zhì)量濃度，按照說明書進(jìn)行操作，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線測定范圍為25～2 500 μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜酶解多肽雙酶抑制活性分析

圖1 條斑紫菜酶解多肽分子質(zhì)量分布（a）和相對含量（b）Fig. 1 Molecular mass distribution (a) and relative contents (b) of peptides from enzymatic hydrolysis of Porphyra yezoensis

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，調(diào)控碳水化合物降解為單糖的反應(yīng)[24]。α-葡萄糖苷酶抑制劑和α-淀粉酶抑制劑可以延緩多糖向單糖的轉(zhuǎn)化。DPP-IV抑制劑通過抑制DPP-IV對GLP-1的降解，提高餐后胰島素水平。通過測定條斑紫菜酶解多肽對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及DPP-IV的抑制活性，評價其體外降血糖功效。

如圖1所示，條斑紫菜經(jīng)中性蛋白酶、堿性蛋白酶、氨肽酶復(fù)配酶解后主要為1 000 Da以下小分子多肽，占97.10%。其中，180～500 Da多肽相對含量最高為51.32%，＜180 Da次之。說明紫菜蛋白經(jīng)酶解得到的主要為二肽到五肽等小分子活性肽。酶解液經(jīng)10 kDa超濾膜除去多糖等雜質(zhì)后，再經(jīng)1 000 Da膜進(jìn)行納濾收集透過液，如表1所示，1 000 Da以下粗肽液對α-葡萄糖苷酶的IC50值19.83 μg/mL低于陽性對照阿卡波糖的IC50值35.65 μg/mL，對DPP-IV的IC50值517.04 μg/mL高于陽性對照Diprotin A的IC50值69.67 μg/mL，說明粗肽液雙酶活性中糖苷酶抑制活性表現(xiàn)更突出，這種分子質(zhì)量范圍較小的天然原料酶解肽往往還具備胃腸耐受性好、吸收快的特點，未來食品工業(yè)使用天然產(chǎn)物來源的抑制劑是一種必然的發(fā)展趨勢[25]。

表1 粗肽液體外抑制活性Table 1 In vitro inhibitory activities of crude peptide solution against α-glucosidase and DPP-IV

目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑的天然來源主要是植物和微生物兩類[26]。馮學(xué)珍等[18]通過萃取獲得的紫菜乙酸乙酯提取部位具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為7.89 mg/mL。Nguyen等[27]發(fā)現(xiàn)類芽孢桿菌TKU042的次級代謝產(chǎn)物高龍膽酸對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.22 mg/mL。 近年來研究顯示，除了駱駝乳[28]、馬乳清蛋白[29]等乳蛋白酶解產(chǎn)物具有DPP-IV抑制活性外，小麥[30]、大豆[31]等 植物蛋白也是DPP-IV抑制肽的重要來源。關(guān)于紫菜蛋白作為DPP-IV抑制肽卻尚未有研究。Wang Feng等[32]證實了燕麥谷蛋白、青稞谷蛋白、蕎麥谷蛋白對DPP-IV的IC50值分別為840、850、980 μg/mL，其抑制效果弱于紫菜酶解多肽。

2.2 粗肽液穩(wěn)定性表征

2.2.1 pH值、溫度穩(wěn)定性

如圖2a所示，條斑紫菜酶解多肽具有較寬的pH值耐受范圍。在pH 3～10范圍內(nèi)，條斑紫菜酶解多肽對α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率達(dá)98%以上；DPP-IV抑制活性保持率在pH 3～8范圍內(nèi)逐漸上升且總體抑制活性保持率高于96%，pH 8.0以上時開始逐漸降低。因此，紫菜多肽在應(yīng)用于生產(chǎn)時應(yīng)注意其pH值環(huán)境，盡量避免置于強(qiáng)堿環(huán)境下。

圖2 粗肽液對兩種酶的pH值（a）、溫度（b）穩(wěn)定性Fig. 2 Effect of pH (a) and temperature (b) on the inhibitory activity of crude peptide solution against α-glucosidase and DPP-IV

通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，溫度100 ℃以下對抑制活性沒有影響。本研究控制恒定溫度100 ℃，探究不同的孵育時間對兩種酶抑制活性的影響。結(jié)果表明，條斑紫菜酶解多肽經(jīng)100 ℃處理5 h后對α-葡萄糖苷酶抑制活性無影響，DPP-IV抑制活性在處理3 h后才顯著下降（圖2b）。粗肽液具有良好的耐熱性，高溫對其2 種酶的抑制活性影響都較小，后期加工過程中可以采用100 ℃、20 min煮沸滅菌。

2.2.2 體外模擬胃腸消化

圖3 粗肽液對兩種酶的胃腸消化穩(wěn)定性Fig. 3 Effect of gastrointestinal digestion on inhibitory activity of crude peptide solution against α-glucosidase and DPP-IV

粗肽液經(jīng)胃消化階段后，其α-葡萄糖苷酶抑制活性穩(wěn)定不變，再經(jīng)十二指腸環(huán)境下胰蛋白酶作用后抑制率升高了30.48%；DPP-IV抑制率在胃消化和腸消化階段都有一定的提高，分別上升了15.38%、39.23% （圖3）。天然的活性肽是否能作為降血糖藥物的代替品，需確定多肽經(jīng)口腔、胃進(jìn)入腸道后活性是否發(fā)生改變。實驗結(jié)果表明，條斑紫菜酶解多肽進(jìn)入酸性很強(qiáng)的胃部環(huán)境和復(fù)雜的腸道環(huán)境后抑制活性都呈上升趨勢，證明消化過程對兩種酶抑制活性有促進(jìn)作用。在消化過程中，多肽體系中仍有部分肽鏈經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶作用發(fā)生斷裂[33]。

2.3 凝膠過濾層析分離

基于粗肽液較高的雙酶抑制活性，良好的pH值、溫度和胃腸消化穩(wěn)定性，對粗肽液進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，解析其多肽氨基酸組成。凝膠過濾層析是按分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的，Sephadex G-10交聯(lián)度高、網(wǎng)孔小，分級范圍小于700 Da[34]。如圖4a所示，納濾后的條斑紫菜酶解液經(jīng)Sephadex G-10凝膠過濾層析純化后，有2 個活性峰，分別為峰1和峰2。對峰1、峰2進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，備用。如圖4b所示，多肽質(zhì)量濃度為 0.5 mg/mL時，峰1對α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制率分別為71.24%、35.73%，峰2對α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制率分別為93.15%、69.53%。峰2組分對兩種酶的抑制活性均強(qiáng)于峰1，說明后出峰的小分子肽發(fā)揮更顯著的雙酶抑制活性。收集峰2組分，冷凍干燥，備用。

圖4 Sephadex G-10凝膠層析圖譜（a）及各個峰的抑制活性（b）Fig. 4 Sephadex G-10 gel chromatogram (a) and inhibitory activity of each fraction (b) against α-glucosidase and DPP-IV

2.4 UPLC-ESI-Q-TOF-MS鑒定分析

對2.3節(jié)中活性峰2進(jìn)行UPLC-MS分析鑒定。如圖5所示，0～4 min為溶劑峰，樣品峰主要集中在4～25 min。根據(jù)各峰的分離效果和響應(yīng)值大小，利用MassLynx V4.1軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)保留時間為5.28 min和14.84 min處的洗脫峰在220 nm波長處具有較強(qiáng)的紫外吸收。5.28 min和14.84 min處2 個洗脫峰峰形左右對稱，響應(yīng)值高，純化效果好，可能為主要的活性物質(zhì)[35]。如圖6所示，5.28 min和14.84 min處2 個信號峰的分子離子峰[M＋H]＋分別為m/z188、329，計算其分子質(zhì)量分別為187、328 Da。經(jīng)MaxEnt3和PepSep分析確定其氨基酸組成分別為Ala-Pro（圖6a）、Pro-Gly-Gly-Val（圖6b）。這與報道的DPP-IV抑制肽大多為二肽到五肽相符合，且大多數(shù)DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)中含有Ala和Pro，一般N端的第一或第二個氨基酸為Pro或Ala[36]。

圖5 活性峰2的UPLC圖Fig. 5 UPLC of fraction 2

圖6 Ala-Pro（a）和Pro-Gly-Gly-Val（b）二級質(zhì)譜圖Fig. 6 Tandem mass spectra of Ala-Pro (a) and Pro-Gly-Gly-Val (b)

2.5 合成肽的活性表征

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)[19]，條斑紫菜蛋白酶解液經(jīng)分離純化得到的三肽Ala-Ala-Ala對α-葡萄糖苷酶有顯著抑制作用（IC50=97.36 μg/mL）。對新型肽Ala-Pro、Pro-Gly-Gly-Val進(jìn)行合成，純度為99.69%。對合成肽的α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性分別進(jìn)行表征，如表2所示，Ala-Pro對DPP-IV表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其IC50為4.65 mmol/L，對α-葡萄糖苷酶無抑制活性；Pro-Gly-Gly-Val具有α-葡萄糖苷酶和DPP-IV雙酶抑制活性，IC50分別為18.60 mmol/L和17.80 mmol/L。

表2 合成肽的雙酶抑制活性表征Table 2 Characterization of double-enzyme inhibitory activities of synthetic peptides

3 結(jié)論與討論

本研究以條斑紫菜為原料酶解制備α-葡萄糖苷酶、DPP-IV雙酶抑制活性肽。條斑紫菜蛋白酶解液經(jīng)超濾、納濾得到的1 000 Da以下小分子多肽液對α-葡萄糖苷酶和DPP-IV的IC50值分別為19.83、517.04 μg/mL，且pH值、溫度及胃腸消化穩(wěn)定性強(qiáng)。經(jīng)Sephadex G-10凝膠過濾層析、UPLC-ESI-Q-TOF-MS純化分析，由MassLynx V4.1軟件對二級質(zhì)譜中的特征碎片峰進(jìn)行鑒定得到新型肽Ala-Pro、Pro-Gly-Gly-Val。通過表征其α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性發(fā)現(xiàn)，Ala-Pro具有單獨的DPP-IV抑制活性，Pro-Gly-Gly-Val具有雙酶抑制活性。

由2～4 個氨基酸結(jié)合形成的小肽具有特別的小肽吸收機(jī)制，Smith等[37]首次提出并證實了小肽可被完整的吸收。純化得到的α-葡萄糖苷酶、DPP-IV雙酶抑制活性肽均為短肽，更有利于人體的消化吸收，可發(fā)展成為潛在的口服降血糖多肽產(chǎn)品。

紫菜蛋白經(jīng)酶解產(chǎn)生的多肽片段數(shù)目和種類較多，粗肽液表現(xiàn)出較強(qiáng)的雙酶抑制活性。進(jìn)一步分離純化后，單一成分純度提高，α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性提高不明顯。由此推測，除肽解析過程中存在遺漏外，不同結(jié)構(gòu)的抑制肽之間可能存在協(xié)同或者聯(lián)合抑制作用[38-39]。新型肽的抑制機(jī)理及協(xié)同抑制作用有待進(jìn)一步研究。