王強(qiáng)，楊靜，修成奎，孫偉，李琪琳，于潔，王輝奇，霍艷明

益氣溫陽活血利水方對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞線粒體自噬的影響

王強(qiáng)1，楊靜2，修成奎2，孫偉1，李琪琳1，于潔1，王輝奇1，霍艷明1

1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700

觀察益氣溫陽活血利水方對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷后線粒體自噬的影響。戊巴比妥鈉誘導(dǎo)建立H9C2心肌細(xì)胞自噬模型。實驗分為空白對照組、模型組、去乙酰毛花苷組和益氣溫陽活血利水方低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物。運用電子顯微鏡觀察自噬小體、線粒體超微結(jié)構(gòu)，三磷酸腺苷（ATP）試劑盒檢測心肌細(xì)胞ATP濃度，運用活性氧（ROS）熒光探針測定ROS含量，Western blot檢測自噬蛋白Beclin 1的表達(dá)。與模型組比較，益氣溫陽活血利水方干預(yù)后H9C2細(xì)胞線粒體邊界較清晰，腫脹緩解，空泡明顯減少，ATP含量明顯增加（＜0.05），ROS含量減少，自噬小體數(shù)量減少；益氣溫陽活血利水方中、高劑量組H9C2細(xì)胞Beclin 1表達(dá)明顯降低（＜0.05，＜0.01）。益氣溫陽活血利水方減少戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷與抑制線粒體自噬密切相關(guān)，這可能是其治療心力衰竭的重要機(jī)制之一。

益氣溫陽活血利水方；H9C2心肌細(xì)胞；線粒體自噬；心力衰竭

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，線粒體氧化磷酸化成為心肌細(xì)胞提供能量的主要場所。線粒體質(zhì)量控制是維持線粒體的結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，是細(xì)胞免受線粒體損害的重要防御機(jī)制[1]。線粒體自噬是細(xì)胞依賴溶酶體對線粒體降解過程，是細(xì)胞自噬的重要組成部分，可有效清除功能失調(diào)的線粒體，保持線粒體完整性[2]。心力衰竭是心肌能量代謝重塑和心室重塑，線粒體自噬功能失調(diào)會導(dǎo)致心力衰竭的進(jìn)展。因此，從線粒體自噬研究心力衰竭的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。本課題組前期臨床研究表明，在規(guī)范抗心力衰竭西藥治療的基礎(chǔ)上加用益氣溫陽活血利水中藥治療慢性心力衰竭，在中醫(yī)證候積分、早期改善心力衰竭患者的運動耐力及明尼蘇達(dá)心力衰竭生活質(zhì)量評分方面較單純西藥治療組有顯著優(yōu)勢，且證候改善及6分鐘步行試驗提高較空白對照組提前1周出現(xiàn)，提示應(yīng)用中醫(yī)藥干預(yù)治療可改善心力衰竭的癥狀，并可提高慢性心力衰竭患者的生存質(zhì)量[3-4]。但是從線粒體自噬角度研究益氣溫陽活血利水方對心力衰竭的干預(yù)作用較少。因此，本研究通過戊巴比妥鈉誘導(dǎo)方法建立H9C2心肌細(xì)胞線粒體自噬模型，觀察益氣溫陽活血利水方對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞線粒體自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

益氣溫陽活血利水方（黨參30 g，黃芪30 g，丹參20 g，赤芍15 g，桑白皮15 g，葶藶子15 g，車前子15 g，益母草15 g，澤蘭15 g，澤瀉15 g，制附片6 g，茯苓15 g），飲片購自中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房，加10倍量水，50%乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮，60 ℃減壓干燥，即得復(fù)方干浸膏，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備。原藥材含量約為4.3 g/g干膏粉。去乙酰毛花苷，成都貝特藥業(yè)有限公司，批號181001。

1.2 細(xì)胞和試劑

H9C2大鼠心肌細(xì)胞株，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心。三磷酸腺苷（ATP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號A095-2-1），活性氧（ROS）試劑盒（美國SIGMA-ALDRICH公司，貨號MAK114），兔Beclin 1多克隆抗體（英國Abcam公司，貨號ab55878），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號A0208），戊二醛溶液（美國SIGMA-ALDRICH公司，貨號G5882），高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司，貨號S3568）。

1.3 儀器

超凈工作臺（新加坡ESCO公司，型號SVE-4A1），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號MCO-20AIC），精密pH計（英國Mettler-Toledo公司，型號Delta320），倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（德國Leica公司，型號4000B），低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司，型號sepatechbiofuge 28RS），透射電子顯微鏡（日本日立公司，型號H7650），LKB-V超薄切片機(jī)（德國Leica公司，型號emuc-6）。

1.4 造模、分組及給藥

將H9C2大鼠心肌細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底85%左右，加胰蛋白酶消化，按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)和細(xì)胞凍存。將培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，待細(xì)胞長滿瓶底70%～80%，加入0.8%戊巴比妥鈉至H9C2心肌細(xì)胞各規(guī)格培養(yǎng)板中，作用7 min，得到H9C2心肌細(xì)胞損傷模型。

根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，將細(xì)胞分為空白對照組、模型組（0.8%戊巴比妥鈉）、陽性藥組（1.6 mg/L去乙酰毛花苷）、中藥低劑量組（200 mg/L益氣溫陽活血利水方醇提物）、中藥中劑量組（300 mg/L益氣溫陽活血利水方醇提物）、中藥高劑量組（400 mg/L益氣溫陽活血利水方醇提物）。各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物干預(yù)4 h，細(xì)胞0.25%胰酶消化，4 ℃、1500 r/min離心5 min，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

96孔板接種細(xì)胞6×103～8×103個，體積100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合達(dá)70%左右，每孔加入10 μL CCK-8液，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，于酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測光密度值。結(jié)果見表1、表2。

表1 不同濃度益氣活血利水方作用于H9C2心肌細(xì)胞損傷模型CCK8值比較（±s）

注：與模型組比較，##＜0.01

表2 不同濃度去乙酰毛花苷作用于H9C2心肌細(xì)胞損傷模型CCK8值比較（±s）

注：與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

1.6 自噬小體形態(tài)學(xué)觀察

收集藥物干預(yù)4 h H9C2心肌細(xì)胞，制備細(xì)胞混懸液，PBS漂洗2次，離心成團(tuán)，EP管中加2%戊二醛，4 ℃固定過夜，PBS漂洗，1%鋨酸固定，1%醋酸鈾負(fù)染，梯度丙酮脫水，包埋液包埋固化，半薄切片及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行定位，LKB-V超薄切片機(jī)超薄切片，透射電鏡觀察H9C2細(xì)胞形態(tài)。

1.7 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、線粒體結(jié)構(gòu)觀察

按“1.6”項下方法制備細(xì)胞混懸液，運用倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞損傷模型細(xì)胞形態(tài)學(xué)，運用透射電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞損傷模型線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.8 心肌細(xì)胞三磷酸腺苷、活性氧測定

將H9C2心肌細(xì)胞種接種于24孔培養(yǎng)板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合達(dá)70%左右，造模后向每孔內(nèi)加入藥物4 h，然后加入ATP裂解液裂解，4000 r/min離心5 min，運用ATP試劑盒檢測心肌細(xì)胞損傷模型ATP濃度。采用DCFH-DA法檢測H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS相對含量。使用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA（終濃度為10 μmol/L）。將H9C2心肌細(xì)胞種接種于96孔培養(yǎng)板，造模后向每孔內(nèi)加入藥物4 h，PBS清洗細(xì)胞，吸棄上清，加入DCFH-DA稀釋液覆蓋細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS清洗細(xì)胞2次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，收集細(xì)胞。使用顯微鏡檢測熒光強(qiáng)度，平均熒光信號強(qiáng)度代表相對ROS含量。

1.9 Western blot檢測心肌細(xì)胞Beclin 1蛋白表達(dá)

RIPA蛋白抽提試劑提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性5 min，10%SDS- PAGE電泳后半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)膜，5%BSA-TBST封閉1 h，按比例稀釋Beclin 1（1︰500）、LC3B（1︰1000）一抗，4 ℃水平搖床孵育過夜，山羊抗兔IgG（H+L）二抗1︰3000室溫孵育40 min，上機(jī)熒光掃描，以GAPDH為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益氣活血利水方對H9C2心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

模型組可見H9C2心肌細(xì)胞線粒體邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解甚至嵴斷裂現(xiàn)象，可見空泡樣變；與模型組比較，中藥各劑量組和陽性藥組H9C2心肌細(xì)胞線粒體邊界較清晰，腫脹緩解，空泡明顯減少。見圖1。

圖1 各組H9C2心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)（×30 000）

2.2 益氣活血利水方對H9C2心肌細(xì)胞三磷酸腺苷、活性氧水平的影響

與模型組比較，中藥低、高劑量組H9C2心肌細(xì)胞ATP含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），見表3。熒光強(qiáng)弱反映線粒體活性氧的水平，模型組H9C2心肌細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)，ROS含量明顯增加；與模型組比較，中藥高、中、低劑量組和陽性藥組H9C2心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減弱，ROS含量明顯降低，見圖2。

2.3 益氣活血利水方對H9C2心肌細(xì)胞自噬體的影響

與模型組比較，中藥高、中、低劑量組和陽性藥組H9C2心肌細(xì)胞線粒體腫脹緩解，自噬小體數(shù)量減少（箭頭所指），空泡含量減少，線粒體膜較完整，見圖3。

表3 各組H9C2心肌細(xì)胞ATP含量比較（±s）

注：與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

圖2 各組H9C2心肌細(xì)胞ROS陽性表達(dá)（熒光探針，×200）

圖3 各組H9C2心肌細(xì)胞線粒體自噬變化（×30 000）

2.4 益氣活血利水方對H9C2心肌細(xì)胞對Beclin 1蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，中藥中、高劑量組和陽性藥組H9C2心肌細(xì)胞Beclin 1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見表4、圖4。

表4 各組H9C2心肌細(xì)胞Beclin 1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

注：A.空白對照組；B.模型組；C.中藥低劑量組；D.中藥中劑量組；E.中藥高劑量組；F.陽性藥組

3 討論

線粒體是心肌細(xì)胞的能量工廠，產(chǎn)生能量的同時也生成ROS，尤其是線粒體損傷時，線粒體功能下降，產(chǎn)生過多的ROS，出現(xiàn)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡、炎癥和衰老。線粒體自噬對維持線粒體的正常功能有重要作用，其失調(diào)導(dǎo)致線粒體異常堆積，引起心肌細(xì)胞死亡和收縮功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭。本研究發(fā)現(xiàn)，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷后ATP水平下降，ROS水平明顯升高，線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯破壞。與戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷模型組比較，益氣溫陽活血利水方干預(yù)后ATP含量增加，ROS水平下降，線粒體邊界較清晰，腫脹緩解，空泡明顯減少，提示益氣溫陽活血利水方有維持線粒體正常結(jié)構(gòu)、促進(jìn)能量產(chǎn)生、減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的作用。

益氣溫陽活血利水方為郭維琴教授和霍艷明主任醫(yī)師臨床經(jīng)驗方，方中黨參、黃芪補益心氣，附子溫陽通脈以治本，丹參、赤芍、澤蘭活血化瘀，茯苓、桑白皮、葶藶子、車前子、澤瀉利水消腫以治標(biāo)。沈淑靜等[5]采用腹主動脈縮窄法制作壓力超負(fù)荷性心力衰竭兔模型，研究表明益氣溫陽活血利水中藥可改善心力衰竭兔血流動力學(xué)指標(biāo)，保護(hù)心臟收縮功能，延緩心力衰竭發(fā)展。黃平東等[6]實驗研究發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽活血利水藥可明顯降低模型大鼠心室重量指數(shù)和基質(zhì)金屬蛋白酶活性。牟金亭等[7]臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療組患者左室舒張末期內(nèi)徑明顯縮小，舒張末室間隔厚度明顯下降，左室射血分?jǐn)?shù)顯著提高，療效明顯優(yōu)于西藥綜合治療組。馮偉等[8]臨床研究發(fā)現(xiàn)，治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用益氣溫陽活血利水方，不僅提高心腎綜合征患者射血分?jǐn)?shù)，降低B型利鈉肽水平，且改善腎臟功能。也有學(xué)者臨床研究發(fā)現(xiàn)，在西藥基礎(chǔ)上加服益氣溫陽活血利水中藥治療慢性充血性心力衰竭療效確切，能有效改善患者癥狀，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌，降低白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、超敏C反應(yīng)蛋白水平[9]。張良等[10]臨床研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合益氣溫陽活血利水法可提高慢性心力衰竭臨床療效，改善循環(huán)miR-423-5p表達(dá)水平。鄧?yán)11]通過對2008－2018年益氣溫陽活血利水中藥治療慢性心力衰竭的隨機(jī)對照研究文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽活血利水中藥聯(lián)合西藥可減小左室舒張末內(nèi)徑，提高左室射血分?jǐn)?shù)，增加6分鐘步行距離，提高臨床綜合療效。吳獻(xiàn)等[12]通過對益氣溫陽活血利水法治療慢性心力衰竭文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽活血利水法可改善心功能，延緩心室重構(gòu)，提高生活質(zhì)量和改善遠(yuǎn)期預(yù)后。大量基礎(chǔ)、臨床研究及文獻(xiàn)綜述表明，益氣溫陽活血利水中藥具有改善心力衰竭癥狀、保護(hù)缺血心肌、抑制心室重塑、改善心功能、提高生活質(zhì)量、改善遠(yuǎn)期預(yù)后的作用。

有關(guān)益氣溫陽活血利水中藥防治心力衰竭體外研究較少。體外研究細(xì)胞干預(yù)方式目前主要包括藥物血清和直接加藥法。其中血清中內(nèi)源性活性物質(zhì)雖然滅活，但仍可能影響體外細(xì)胞、組織的生物活性，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。直接加藥法是采用中藥提取物或提取部位干預(yù)體外模型，中藥提取物中雜質(zhì)對細(xì)胞活性影響較大，因此，中藥的加工工藝尤為重要。本實驗藥物通過多次醇提和蒸餾后所含雜質(zhì)相對較少。前期體內(nèi)及體外研究發(fā)現(xiàn)，人參三七川芎醇提物可延緩大鼠衰老、內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞衰老[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽活血利水方可緩解線粒體腫脹緩，減少自噬小體和空泡含量，改善線粒體膜完整性，從而降低戊巴比妥鈉誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷，這可能與抑制線粒體自噬的過度激活、降低自噬蛋白Beclin 1表達(dá)密切相關(guān)。

綜上，益氣溫陽活血利水方可通過抑制線粒體自噬、提高ATP水平、減少ROS產(chǎn)生，達(dá)到減少戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷作用，其抑制線粒體自噬作用的相關(guān)機(jī)制應(yīng)從心力衰竭調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白和線粒體膜外蛋白的調(diào)節(jié)作用方面進(jìn)行研究。

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Effects ofPrescription on Pentobarbital Sodium-induced Mitophagy in H9C2 Cardiomyocytes

WANG Qiang1, YANG Jing2, XIU Chengkui2, SUN Wei1, LI Qilin1, YU Jie1, WANG Huiqi1, HUO Yanming1

To observe the effects ofPrescription on pentobarbital sodium-induced mitophagy in H9C2 cardiomyocytes.An H9C2 cardiomyocyte autophagy model was established by pentobarbital sodium induction method. The experiment was divided into blank control group, model group, deacetylethrin group andPrescription low-, medium- and high-dosage groups. Each administration group was given relevant medicine. Ultrastructures of autophagosomes and mitochondria were observed using an electron microscope, and ATP concentration of cardiomyocytes was detected by ATP kit. Reactive oxygen species (ROS) fluorescent probes were used to determine ROS content, and Western blot was used to detect the expression of autophagy protein Beclin 1.Compared with the model group, the mitochondrial boundary of H9C2 cells was clearer, the swelling of mitochondria was relieved, the vacuoles of mitochondria were significantly reduced, the content of ATP increased (<0.05), the content of ROS decreased, and the number of autophagosomes decreased after the intervention ofPrescription; the protein expression of Beclin 1 inPrescription medium- and high-dosage groups decreased significantly (<0.05,<0.01).Reducing pentobarbital sodium-induced H9C2 cells damage byPrescription is closely related to the inhibition of mitophagy, which may be one of its important mechanisms for treating heart failure.

Prescription; H9C2 cardiomyocytes; mitophagy; heart failure

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0043-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004531

國家自然科學(xué)基金（81703865）；北京市科委重大專項（z171100001017108）

霍艷明，E-mail：huoym98@163.com

（2020-04-22）

（2020-05-18；編輯：華強(qiáng)）