代謝組學研究技術(shù)及其在銀屑病研究中的應(yīng)用進展

舒 心，王 睿，黃 敏 綜述 李承新 審校

代謝組學是繼基因組學和蛋白組學之后新發(fā)展起來的一門學科，是以研究細胞、組織或生物體受刺激后代謝組變化的科學，其研究對象大多是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)，目前已滲透到多項領(lǐng)域，如疾病診斷、醫(yī)藥研發(fā)及營養(yǎng)食品科學等。代謝物是指作為細胞通路底物、中間體和產(chǎn)物的小分子物質(zhì)。代謝物的研究一直是我們了解人類健康和疾病不可或缺的一部分。一個生物系統(tǒng)中所有的代謝物共同組成了代謝組，它代表了基因表達、表觀遺傳學、蛋白質(zhì)活性和環(huán)境影響的最終結(jié)果。近幾年，代謝組學已被應(yīng)用于皮膚病的研究，包括識別轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[1-2]、基底細胞癌[3]、急性間歇性卟啉癥[4]和特應(yīng)性皮炎[5]等特異性生物標志物。銀屑病是一種慢性炎性反應(yīng)性疾病，具有免疫介導的多基因遺傳性，一直是皮膚科研究的重點和難點。近幾年，代謝組學研究為銀屑病發(fā)病機制的探索和特異性診斷生物標記物的尋找提供了重要依據(jù)，因此也是皮膚科領(lǐng)域非常有價值的一個研究。筆者就常用的代謝組學分析方法、銀屑病代謝組學的研究成果及進展做一綜述。

1 代謝組學研究技術(shù)

代謝組學研究可分為靶向和非靶向兩種。靶向代謝組學是對一組預(yù)先指定的代謝物進行分析，通常與一個特定的通路或代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)；非靶向代謝組學研究目標是產(chǎn)生代謝活動的整個網(wǎng)絡(luò)框架，不僅僅是特定的已被預(yù)先定義的代謝物。非靶向代謝組學研究方法包括代謝指紋識別及代謝產(chǎn)物分析，代謝指紋識別是利用代謝物組成的模式來分類或識別樣本，而代謝產(chǎn)物分析則是同時測量盡可能多的代謝物，全面反映生物系統(tǒng)中的代謝活動。上述代謝組學所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是高通量的，非常復雜，需經(jīng)過專業(yè)的生物信息學軟件處理，如各種形式的色譜質(zhì)量譜等，并需要與代謝物數(shù)據(jù)庫相比照，如METLIN[6]數(shù)據(jù)庫和人類代謝組數(shù)據(jù)庫[7]。同時，為了更好地解釋這些處理后的數(shù)據(jù)，它必須被映射到代謝途徑數(shù)據(jù)庫，如MetaboAnalyst[8]和MetaMapR[9]，從而進行代謝通路和網(wǎng)絡(luò)的分析。

目前，代謝組學在臨床研究中常用的檢測技術(shù)包括核磁共振技術(shù)( nuclear magnetic resonance，NMR) 、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-massspectrometer，GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquidchromatography-mass spectrometer，LC-MS)等，主要用于檢測血液、尿液、唾液和組織等生物標本中代謝物的變化[10、11]。NMR具有快速、全面、樣品處理簡單、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是代謝組學研究領(lǐng)域最為常用的分析技術(shù)之一，目前已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、新藥研發(fā)等領(lǐng)域[12]。GC-MS氣相色譜具有較高的靈敏度和分析效能，在疾病診斷研究中亦有一定應(yīng)用，但GC需對樣品進行衍生化處理，并受組分揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性所限,在疾病診斷中的應(yīng)用具有一定局限性[11]。LC-MS 技術(shù)用于代謝組學的研究最晚，但由于LC-MS 技術(shù)本身的強大優(yōu)勢及其與NMR和GC-MS 技術(shù)的互補性，它的發(fā)展速度及應(yīng)用已經(jīng)超越了NMR和GC-MS。相比較而言，LC-MS 避免了GC-MS中繁雜的樣品前處理，且由于其較高的靈敏度和較寬的動態(tài)范圍，現(xiàn)已被越來越多地用于代謝組學的研究，尤其是非常適合于生物樣本中復雜代謝產(chǎn)物的檢測和潛在標志物的鑒定[13]。

2 在銀屑病研究中的應(yīng)用進展

2.1 皮膚代謝組學 通過皮膚代謝組學研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了銀屑病患者皮損與健康對照組皮膚中代謝產(chǎn)物的差異。在這些代謝物中，有一些與皮膚增生和高代謝相關(guān)，如谷氨酸、膽堿、纈氨酸、葡萄糖和肌醇。文獻[14，15]利用NMR和GC-MS兩項研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，銀屑病患者皮損中的谷氨酸含量增加，這種增加可能是由于在細胞增生、蛋白質(zhì)快速合成和細胞因子產(chǎn)生過程中對谷氨酰胺的需求增加引起的。同時，膽堿是細胞生長和分裂所需要的基本物質(zhì)，膽堿在銀屑病病變皮損中的含量明顯高于健康對照組。此外，根據(jù)銀屑病斑塊嚴重程度量表，發(fā)現(xiàn)谷氨酸和膽堿與銀屑病嚴重程度呈正相關(guān)，這可能是由于細胞增殖和炎性反應(yīng)增加所致。

皮膚的代謝組學不但揭示了銀屑病細胞高周轉(zhuǎn)率和免疫失調(diào)的生化特征，同時也證實了銀屑病的發(fā)病機制可能與角質(zhì)形成細胞的過度增殖有關(guān)。Abeyakirthi等[16]應(yīng)用高效液相色譜質(zhì)譜法(HPLC-MS)分析了健康對照組和銀屑病患者的皮損樣本，結(jié)果表明，在銀屑病病變皮損中，鳥氨酸水平升高，精氨酸水平下降。這些代謝紊亂是由于精氨酸酶1的過表達，后者是一種與誘導型一氧化氮合酶(iNOS)競爭共享底物精氨酸的酶。精氨酸酶1增加精氨酸的使用，降低了其對iNOS的利用，從而導致NO水平降低，促進了銀屑病表皮增生。除了NOS通路外，花生四烯酸代謝物已被證實為銀屑病發(fā)病機制的潛在促進因素，并有希望成為銀屑病有效的治療靶點。花生四烯酸是一種多不飽和-6脂肪酸(PUFA)，可被環(huán)氧合酶21、脂氧合酶(LOX)22和細胞色素P450酶氧化成多種二十烷酸[17]。值得注意的是，脂氧合酶 (LOX)途徑產(chǎn)生的羥二十烷四烯酸(HETEs)和白三烯B4 (LTB4)，即白細胞趨化劑，可誘導角質(zhì)形成細胞活化和中性粒細胞介導的銀屑病。其他一些基于皮膚的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸、羥二十烷四烯酸(HETEs)和白三烯B4(LTB4)在銀屑病皮損中濃度較高，從而證實了銀屑病皮損中脂氧合酶(LOX)介導的白三烯的生成在銀屑病發(fā)病機制中的重要作用[18,19]。

與血液和尿液樣本代謝組學研究相比，皮膚組織提供了對銀屑病發(fā)病過程和皮膚局部變化最直觀的反映。雖然皮膚代謝組學具有侵襲性，但直接對銀屑病病變進行采樣，可以將代謝組學數(shù)據(jù)與病變形態(tài)、局部炎性細胞和角質(zhì)形成細胞的基因表達數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。因此，基于皮膚的代謝組學最有可能闡明誘發(fā)疾病的免疫機制，并確定有效的治療靶點。

2.2 血液代謝組學 銀屑病代謝物不僅可在皮膚上進行研究，血液樣本色譜技術(shù)的出現(xiàn)也為進一步探索銀屑病代謝過程提供了可能。血中關(guān)鍵代謝物(包括氨基酸、脂質(zhì)和脂肪酸衍生物)的比值和濃度已被證實在銀屑病和其他自身免疫性疾病的發(fā)病、預(yù)后和治療中發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物往往是復雜代謝途徑的最終產(chǎn)物，因此常與疾病的性質(zhì)類型關(guān)系最為密切。因此，了解銀屑病患者的氨基酸譜可以更好地了解疾病的轉(zhuǎn)歸過程。也就是說，從分子水平了解銀屑病的發(fā)病機制一直是銀屑病研究領(lǐng)域的重點和難點。Armstrong等[20]利用GC-MS分析了尋常型銀屑病、關(guān)節(jié)型銀屑病和健康對照組血清代謝產(chǎn)物差異，以闡明銀屑病的發(fā)病機制，包括角質(zhì)形成細胞增生和免疫細胞的過度激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，銀屑病患者的谷氨酰胺和天冬酰胺總體水平較低。細胞蛋白合成和生長中起重要作用的谷氨酰胺，可能被銀屑病患者體內(nèi)過度活躍的免疫細胞所消耗。同時，天冬酰胺在高氧化應(yīng)激的環(huán)境中，如銀屑病炎性環(huán)境中，會發(fā)生破壞和自發(fā)脫酰胺。因此，銀屑病患者較低水平的天冬酰胺可能反映了銀屑病中較高的細胞周轉(zhuǎn)率和慢性炎性狀態(tài)。2015年Kamleh等[21]進行的LC-MS研究和Kang等[22]在一項對銀屑病及健康人的GC -MS研究均顯示，尿素循環(huán)、精氨酸和脯氨酸途徑的活性增加，并發(fā)現(xiàn)異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸水平在銀屑病患者中升高。除此之外，這些支鏈脂肪酸在糖尿病和心血管疾病中也會升高，預(yù)示著銀屑病與心臟及一些代謝疾病之間存在密切關(guān)系[23-25]。Li等[26]通過對75例銀屑病及75名健康人的血清LC-MS代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)銀屑病主要代謝途徑涉及甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、花生四烯酸代謝,并尋找出44個顯著差異的代謝產(chǎn)物，包括溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油及磷脂酰乙醇胺等。

血清代謝組學也可被用來區(qū)分銀屑病和其他自身免疫性疾病。利用LC-MS和GC-MS的組合，Madsen等[27]比較了類風濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)型銀屑病和健康對照組之間的血清代謝物。他們的研究明確了可用于區(qū)分關(guān)節(jié)型銀屑病和類風濕關(guān)節(jié)炎的血清代謝物變化特征譜，敏感度達90%，特異度達94%。關(guān)節(jié)型銀屑病患者與類風濕關(guān)節(jié)炎患者相比，其谷氨酸和絲氨酸水平較高，谷氨酰胺水平較低,與Kamleh等[21]的研究結(jié)果一致，從而進一步強調(diào)了代謝組學對鑒別疾病和檢測生物標記物的巨大潛力。

2.3 尿液代謝組學 以尿液為基礎(chǔ)的代謝組學分析方法具有簡單、無創(chuàng)的特點，值得在臨床廣泛推廣。目前在國內(nèi)外醫(yī)學文獻中，只有少量利用尿液代謝組學研究銀屑病的文獻報道。2015年，Setkowicz等[28]通過分析尿代謝物12-羥二十烷四烯酸(12(S)-HETE)與皮損嚴重程度的關(guān)系，確定了尋常型銀屑病和關(guān)節(jié)型銀屑病患者的診斷生物標志物。該研究提出，12-羥二十烷四烯酸(12(S)-HETE)作為一種有效的白細胞趨化劑，是一種花生四烯酸鹽脂氧合酶(LOX)的代謝產(chǎn)物，已被證實在銀屑病患者皮損中含量明顯增加。因此，可作為診斷尋常型銀屑病的一種特異性生物標志物。Alonso等[29]通過比較尋常型銀屑病、關(guān)節(jié)型銀屑病、類風濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的代謝產(chǎn)物特征，研究尿液中其他潛在的生物標記物。與對照組相比，尋常型銀屑病和關(guān)節(jié)型銀屑病的檸檬酸鹽、丙氨酸、甲基琥珀酸鹽、葫蘆巴堿、肉堿和馬尿酸鹽的含量較低。在關(guān)節(jié)型銀屑病患者中，枸櫞酸水平與疾病活動性呈負相關(guān)，它對評估疾病嚴重程度和監(jiān)測治療反應(yīng)具有一定幫助。同時，研究結(jié)果表明銀屑病和類風濕關(guān)節(jié)炎具有不同的代謝產(chǎn)物特征，這些差異性的代謝產(chǎn)物可用于它們之間的鑒別診斷，該結(jié)果與Madsens小組的血液代謝組學研究結(jié)果一致[27]。

尿液中檢測出的生物標志物也可以幫助預(yù)測或監(jiān)測治療反應(yīng)。Kapoor等[30]在2013年的一項研究中通過H-NMR(氫核磁共振譜)分析了20例關(guān)節(jié)型銀屑病和16例類風濕性關(guān)節(jié)炎應(yīng)用抗TNF-α藥物英夫利昔單抗及依那西普后尿代謝產(chǎn)物的變化。研究發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗和依那西普對尿液中代謝物的影響不同。英夫利昔單抗治療組尿液中馬尿酸、檸檬酸、乳酸代謝水平較高，而依那西普組尿液中膽堿、苯乙酸代謝物、尿素，肌酸和甲胺水平較高。雖然依那西普和英夫利昔單抗均具有免疫調(diào)節(jié)作用，但它們可誘導不同的基因抑制模式。英夫利昔單抗下調(diào)許多Th1基因，而依那西普則是抑制了促進濾泡樹突狀細胞發(fā)育和淋巴器官生成的基因。這一系列研究結(jié)果強調(diào)了尿液代謝組學可作為一種方便、無創(chuàng)的方法來識別生物標志物并監(jiān)測長期的治療反應(yīng)。

代謝組學已極大地改變了我們對銀屑病的認識。對皮膚、血液和尿液樣本代謝物的研究揭示了健康個體和銀屑病患者之間代謝產(chǎn)物差異的趨勢。高精度、高通量的代謝組學技術(shù)與復雜生物信息學的融合應(yīng)用，為發(fā)現(xiàn)具有重要診斷及治療價值的新型、特異性銀屑病生物標記物開辟了新途徑。代謝組學技術(shù)已成為銀屑病研究中一個有價值的研究工具，但它也有其重要的局限性，如成本高、缺乏標準的診斷濃度標準及需要進行數(shù)據(jù)驗證等。雖然代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)分析為代謝組學數(shù)據(jù)提供了重要的生物學背景，但應(yīng)強調(diào)的是，這些數(shù)據(jù)雖提供了有關(guān)聯(lián)的證據(jù)，但不一定是因果關(guān)系,因此仍需要進一步地分析研究，了解其在銀屑病發(fā)病機制中的作用。