祛痰清瘀方通過抑制ERK-LATS-YAP 信號緩解糖尿病大鼠大血管并發(fā)癥的臨床研究

寇鑫暉 趙恒俠 陳軍 李惠林

糖尿病大血管病變是發(fā)生于主動脈、冠狀動脈、腦基底動脈和腎動脈等處的動脈粥樣(AS)硬化性疾病,糖尿病顯著增加大血管并發(fā)癥的發(fā)生率［1］。正常生理狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞處于靜息狀態(tài),內(nèi)皮細(xì)胞僅在周圍細(xì)胞正常凋亡后短暫進(jìn)入增殖狀態(tài)；而糖尿病病理狀態(tài)下,由于血液中ox-LDL 的刺激使得內(nèi)皮細(xì)胞異?；罨?并持續(xù)進(jìn)入病理性增殖狀態(tài),導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂［2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能紊亂是AS 硬化性疾病的始動因素,過度的內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管重構(gòu)的一個重要因素［3］。如何抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞病理性活化和增殖一直是近年的研究熱點。近期多項研究［4］證實,YAP 蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和增殖方面發(fā)揮重要作用。本文通過ox-LDL 刺激HAoEC 構(gòu)建AS 病理模型,闡述祛痰清瘀方對ox-LDL 誘導(dǎo)HAoEC 活化和增殖的抑制作用及其抑制YAP 活化的潛在機(jī)制,并在動物模型中進(jìn)一步驗證療效,為該方在臨床中用于防治糖尿病大血管病變提供更加充分的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物 12 周齡雄性SD 大鼠60 只,平均體重(250±20)g,實驗操作符合《廣東省實驗動物管理條例》。

1.1.2 細(xì)胞 HAoEC 購于美國Lonza。

1.1.3 藥物和試劑 祛痰清瘀方組方：熟地15 g、當(dāng)歸15 g、赤芍10 g、川芎10 g、紅花10 g、桃仁9 g、半夏15 g、橘紅15 g、白茯苓9 g、甘草4.5 g、地龍10 g,購于本院,制成含生藥2 g/ml 的濃縮液。內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EGM-2)購于美國Lonza；TG、TC、LDL-C、HDL-C 膽固醇試劑盒購于南京建成；CCK8 試劑購于日本同仁；所有抗體購于美國CST。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗 通過喂飼含蔗糖20%、豬油10%、TC 3%、膽酸鹽1%的高脂飼料結(jié)合腹腔注射35 mg/kg STZ 建立大鼠糖尿病模型。將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、祛痰清瘀方組(2.5 g/kg)、辛伐他汀組(20 mg/kg),各10 只。灌胃給藥1 次/d。

1.2.2 含藥血清 給予大鼠0.5 g/100 g 藥物灌胃7 d。動脈采血制備血清,56 ℃滅活30 min。

1.2.3 細(xì)胞實驗 以20 mg/L ox-LDL 刺激HAoEC 建立活化增殖模型,分為對照組、ox-LDL 組和ox-LDL+祛痰清瘀方組,各6 只。細(xì)胞以3×105/ ml 濃度傳代于6 孔板。給藥組以培養(yǎng)基+10%含藥血清處理。

1.2.4 糖脂含量測定 動物禁食12 h,在尾動脈測定FG。腹主動脈采血制血清,以試劑盒測定血清TG、TC,LDL-C 和HDL-C 的濃度。血管組織以氯仿甲醇(1∶1)提取3 d,提取液吹干,無水乙醇定容,試劑盒測定脂質(zhì)含量。

1.2.5 Western blot 蛋白定量 裂解液蛋白配平,煮沸變性。以20 μg 蛋白電泳分離,并電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。一抗室溫孵育2 h,二抗室溫孵育1 h,充分漂洗。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光定量蛋白。

1.2.6 qPCR 裂解液提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)定量CTGF、CYR61 和ANKRD1 mRNA 表達(dá)量,以GAPDH 為內(nèi)參,以2-ΔΔCt法計算待測mRNA 在各組中的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠血糖和血脂水平比較 模型組大鼠血清FG、TG、TC、和LDL-C 水平均顯著高于對照組,HDL-C 水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；模型組大鼠血清TG 水平顯著高于祛痰清瘀方組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；模型組大鼠血清TG、TC 和LDL-C 水平均顯著高于辛伐他汀組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組大鼠血糖和血脂水平比較(,mmol/L)

表1 四組大鼠血糖和血脂水平比較(,mmol/L)

注：與對照組比較,aP＜0.01；與祛痰清瘀方組比較,bP＜0.05；與辛伐他汀組比較,cP＜0.05

2.2 四組大鼠主動脈脂質(zhì)含量比較 模型組大鼠主動脈TG 和TC 含量均顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01 或＜0.05)。見表2。

表2 四組大鼠主動脈脂質(zhì)含量比較(,μmol/g)

表2 四組大鼠主動脈脂質(zhì)含量比較(,μmol/g)

注：與對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組比較,aP＜0.01,bP＜0.05

2.3 四組大鼠內(nèi)皮YAP 表達(dá)水平和ERK1/2 磷酸化水平比較 模型組大鼠主動脈中YAP 的表達(dá)水平及ERK1/2 的磷酸化水平均顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表3 四組大鼠內(nèi)皮YAP 表達(dá)水平和ERK1/2 磷酸化水平比較(,對照組倍數(shù))

表3 四組大鼠內(nèi)皮YAP 表達(dá)水平和ERK1/2 磷酸化水平比較(,對照組倍數(shù))

注：與對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組比較,aP＜0.01

2.4 五組HAoEC 增殖速率比較 ox-LDL 組增殖速率均高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,低于祛痰清瘀方+ERK 過表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表4。

表4 五組HAoEC 增殖速率比較(,對照組倍數(shù))

表4 五組HAoEC 增殖速率比較(,對照組倍數(shù))

注：與對照組、祛痰清瘀方組、辛伐他汀組及祛痰清瘀方+ERK 過表達(dá)組比較,aP＜0.01

2.5 五組細(xì)胞中LATS1/2 和YAP 磷酸化水平比較ox-LDL 組細(xì)胞中LATS1/2 和YAP 的磷酸化水平顯著低于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,Erk1/2 的磷酸化比例顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；祛痰清瘀方+ERK 過表達(dá)組LATS1/2 和YAP 的磷酸化水平低于祛痰清瘀方組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；各組MST1/2 磷酸化水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

2.6 五組細(xì)胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1表達(dá)水平比較 ox-LDL 組細(xì)胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表達(dá)水平顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；祛痰清瘀方+ERK 過表達(dá)組YAP 靶基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表達(dá)水平顯著高于祛痰清瘀方組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表5。

圖1 五組細(xì)胞中LATS1/2 和YAP 磷酸化水平比較(n=6)

表5 五組細(xì)胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表達(dá)水平比較(,對照組倍數(shù))

表5 五組細(xì)胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表達(dá)水平比較(,對照組倍數(shù))

注：與對照組、祛痰清瘀方組、辛伐他汀組,aP＜0.01；與祛痰清瘀方組比較,aP＜0.01

3 討論

糖尿病人群AS 硬化性疾病患病率顯著高于非糖尿患者群 。大血管病變是糖尿病主要死亡因素［5］。目前臨床上主要通過他汀類防治糖尿病大血管病變,療效確定,但該類藥物常引起肝功能異常、肌病,導(dǎo)致部分患者無法堅持治療［6］。開發(fā)能夠改善患者生存的新型中藥制劑,具有廣闊的臨床前景。研究顯示,桃紅四物湯和二陳湯能夠改善糖尿病合并AS 硬化性疾病患者的臨床指標(biāo)［7］。復(fù)方制劑祛痰清瘀方由桃紅四物湯和二陳湯化裁而成,其中,改白芍為赤芍,以加強(qiáng)活血祛瘀之力,同時加入地龍以進(jìn)一步增強(qiáng)活血祛瘀的功效。

糖尿病造成的脂代謝紊亂顯著增加血液中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的水平。ox-LDL 被細(xì)胞表面受體CD36 識別后經(jīng)過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程活化下游信號分子Erk1/2,進(jìn)一步激活YAP［8］?；罨膬?nèi)皮細(xì)胞啟動增殖及轉(zhuǎn)化程序?qū)е卵懿±硇灾貥?gòu)［9］。YAP 是一個近年才被鑒定出的AS 硬化性疾病致病基因［3,4］。ox-LDL 激活YAP,引起YAP 發(fā)生核轉(zhuǎn)位［10］。YAP 的活性除受制于Hippo 信號外,還能被一些絲裂原信號活化,例如Erk1/2 信號［11］。Erk1/2 通過激活YAP,啟動內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程?；罨难軆?nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞停留于內(nèi)皮下空間,并在這里吞噬脂質(zhì),形成脂質(zhì)過載的泡沫細(xì)胞［12］。

本研究中,課題組觀察到ox-LDL 濃度依賴性激活體外培養(yǎng)HAoEC 中的YAP,祛痰清瘀方能夠抑制ox-LDL 對YAP 的活化作用,然而在對信號通路的研究中發(fā)現(xiàn),ox-LDL 及祛痰清瘀方并不影響YAP 經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中上游蛋白MST1/2 的活性,提示ox-LDL 及祛痰清瘀方可能通過其他途徑影響YAP 活性。課題組接下來檢測了可影響YAP 活性的有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL 通過絲裂原信號Erk1/2 激活內(nèi)皮細(xì)胞中的YAP 蛋白,祛痰清瘀方則抑制Erk1/2 的活性。為了驗證此結(jié)果,課題組進(jìn)一步過表達(dá)Erk2 蛋白,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Erk2 能顯著活化YAP,同時抵消祛痰清瘀方抑制YAP 活性的作用。

綜上所述,祛痰清瘀方通過干擾絲裂原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Erk1/2,阻礙YAP 活化,抑制內(nèi)皮細(xì)胞病理性增殖介導(dǎo)的糖尿病大血管病變。