高思宇，吳 佳，謝元棟，詹駱寧，胡 玲，李 毅*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 兒童口腔科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué) 牙發(fā)育與頜骨重塑吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是闡明蛋白質(zhì)水平生物學(xué)過(guò)程的強(qiáng)有力工具，基于質(zhì)譜分析(mass spectrometric analysis，MS)可對(duì)一組基因表達(dá)的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，結(jié)合生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)庫(kù)等工具，可深入探索疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制。本文檢索了蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)最新技術(shù)，并就蛋白質(zhì)組學(xué)在探索口腔疾病生物標(biāo)記物中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為疾病的早期診斷和預(yù)防提供參考。

1 蛋白組學(xué)的定義和技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)是1994年由Marc Wilkins首次提出，可對(duì)一組基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行分析檢測(cè)，在功能基因組學(xué)的研究領(lǐng)域中作用顯著。蛋白質(zhì)組學(xué)具有高通量、高靈敏、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，避免了mRNA因迅速降解和轉(zhuǎn)錄不當(dāng)而引起誤差，尤其是可對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾(posttranslational modifications,PTM)進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，有利于探索口腔疾病生物標(biāo)記分子，主要技術(shù)包括：蛋白質(zhì)分離富集、蛋白質(zhì)定性定量分析、蛋白質(zhì)相互作用分析[1]。

1.1 蛋白質(zhì)分離與富集

生物樣品成分高度復(fù)雜，高效的預(yù)處理可使結(jié)果精準(zhǔn)。樣品純化首先需要溶解蛋白質(zhì)，加入輔助添加劑可提高溶解度，傳統(tǒng)的十二烷基硫酸鈉(SDS)效果不佳，新型溶解劑氯化-1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液體(C12Im-Cl)可高效促進(jìn)蛋白質(zhì)溶劑且具有易除去、酶相容性好、不干擾質(zhì)譜分析的優(yōu)點(diǎn)[2]。常用蛋白質(zhì)分離技術(shù)包括色譜分析法、免疫親和沉淀法和雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)，但色譜分析法中低濃度蛋白富集易受到高濃度掩蓋，免疫親和沉淀法需要高效的純化抗體配伍[3]，2-DE技術(shù)難以分離極酸極堿或分子量過(guò)小過(guò)大的分子[4]。基于選擇性沉淀多肽蛋白的非色譜技術(shù)逐漸興起，該技術(shù)對(duì)蛋白富集尤其是翻譯后修飾分子有顯著提高[5]。二維熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)可利用熒光染料同時(shí)對(duì)多個(gè)預(yù)標(biāo)記樣本進(jìn)行分析，現(xiàn)已逐漸取代2-DE。洗滌劑的性能對(duì)純化效率影響顯著，性能溫和的洗滌劑可以在不影響目的蛋白純化的條件下去除多余雜質(zhì)。常用的SDS和尿素類屬于強(qiáng)洗滌劑，易降低酶切、色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)的效率，十二烷基麥芽糖苷(DDM)作為新型溫和洗滌劑，可在不影響酶活性的情況下增加蛋白溶解性，提高回收率，適用于微量蛋白的翻譯后修飾純化分析[6]。

1.2 蛋白質(zhì)的定性定量

隨著研究的需要和技術(shù)的提高，蛋白質(zhì)組學(xué)的定性定量分析朝著高精準(zhǔn)高覆蓋方向發(fā)展?；谕凰叵♂屬|(zhì)譜原理的MS技術(shù)可對(duì)上千種蛋白質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)定性定量分析，現(xiàn)已是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主導(dǎo)趨勢(shì)?；贛S的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程主要分為自下而上和自上而下：前者是在對(duì)樣本的水解肽進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的定量分析，比如“鳥(niǎo)槍法”；后者是直接對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行MS分析，例如基于軟電離源方法的基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)技術(shù)，通過(guò)產(chǎn)生單電荷離子將樣品吸附于MALDI板后直接進(jìn)行靶向肽成像分析，靈敏度高但并非絕對(duì)定量，適用于定位生物標(biāo)記物[7]。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)“鳥(niǎo)槍法”的補(bǔ)充，首先合成一定數(shù)量穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)肽，然后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽和樣品肽進(jìn)行光譜峰值強(qiáng)度的比較，從而達(dá)到絕對(duì)定量，但由于標(biāo)準(zhǔn)肽的合成費(fèi)時(shí)費(fèi)力、軟件特殊、適用范圍局限而受到限制[8]。無(wú)標(biāo)記同位素定量分析技術(shù)逐漸興起，其原理是在蛋白分子進(jìn)行光譜分析后對(duì)光譜信號(hào)強(qiáng)度或其校準(zhǔn)曲線下面積值(AUC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，多用于對(duì)樣品進(jìn)行相對(duì)定量分析以研究分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路[9]，適用范圍廣、操作簡(jiǎn)單但精準(zhǔn)度較低，目前已有研究對(duì)其進(jìn)行改良，改良方法的精準(zhǔn)度足以代替標(biāo)記定量法，例如蛋白豐度指數(shù)化(emPAI)、灰度絕對(duì)量化(iBAQ)、絕對(duì)蛋白表達(dá)量化(APEX)等[9-10]。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用分析

蛋白質(zhì)分子通常是經(jīng)過(guò)相互作用形成特定復(fù)合體以實(shí)現(xiàn)其生物功能，常見(jiàn)用于分析相互作用技術(shù)包括酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化以及免疫共沉淀法等，但這些方法普遍存在通量低以及無(wú)法精準(zhǔn)確定蛋白作用位點(diǎn)的缺點(diǎn)?；瘜W(xué)交聯(lián)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)在精準(zhǔn)確定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)相互作用及其位點(diǎn)具有優(yōu)勢(shì)，具有速度快、通量高、成本低、范圍廣等優(yōu)勢(shì)[11]，與低溫電鏡技術(shù)結(jié)合后反映蛋白質(zhì)分子間的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)[12]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在探索口腔疾病的生物標(biāo)記物中的應(yīng)用

2.1 牙周炎

牙周炎的主要致病因素來(lái)自宿主(自身免疫反應(yīng))和細(xì)菌[1]，利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)炎性反應(yīng)和細(xì)菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)可用于尋找牙周炎相關(guān)生物標(biāo)記物，牙周炎作為慢性病，相關(guān)病程的診斷至關(guān)重要。Choi[13]等利用MS首次在牙周炎患者齦溝液中發(fā)現(xiàn)天青素在牙周炎中表達(dá)上調(diào)，天青素與破骨分化抑制密切相關(guān)，可作為牙周炎骨修復(fù)程度的診斷指標(biāo)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine protease inhibitor，CSTs)超家族分子已證實(shí)與牙周病關(guān)系密切，主要分為分泌型和胞內(nèi)型，通過(guò)抑制半胱氨酸蛋白酶的水解作用從而發(fā)揮免疫防御和腫瘤抑制[14]，胱抑素C作為典型的分泌型蛋白分子，表達(dá)量與牙周炎嚴(yán)重程度成正相關(guān)[14]，而胱抑素B和胱抑素S與牙周炎成負(fù)相關(guān)，比較其家族分子表達(dá)高低可用于判斷牙周炎進(jìn)程[15]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)蛋白質(zhì)的PTM進(jìn)行研究：D-核糖在參與牙周炎相關(guān)蛋白糖基化修飾時(shí)呈現(xiàn)出較高活性[16]；賴氨酸乙?；鳛镻.G菌的常見(jiàn)代謝模式與牙周炎的P.G菌活躍度有關(guān)[17]。有效的篩查指標(biāo)有助于準(zhǔn)確診斷牙周炎病程，有研究者將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合時(shí)間模式匹配和函數(shù)模擬進(jìn)行縱向研究，對(duì)牙周炎生物標(biāo)記分子進(jìn)行篩選，推薦篩查指標(biāo)包括天青素、溶菌酶C和肌球蛋白-9等[18]、鈣結(jié)合蛋白S100A8和S100A9。

2.2 齲病

口腔環(huán)境的蛋白組成是影響齲病易感程度的重要因素，足量的防齲蛋白在維持礦化平衡、抑制致齲菌生長(zhǎng)中具有關(guān)鍵作用，而防齲蛋白的表達(dá)缺失則意味著高齲率的發(fā)生。有學(xué)者利用iTRAQ/MRM聯(lián)合技術(shù)對(duì)兒童唾液蛋白成分及其相互作用進(jìn)行表征，構(gòu)建了無(wú)齲、低齲和高齲患兒組的蛋白組學(xué)比較圖譜，表達(dá)下調(diào)的關(guān)鍵蛋白包括S100A9、黏蛋白7、黏蛋白5B、富酪蛋白、富組蛋白1、胱抑素S、胱抑素SN以及富堿性脯氨酸涎蛋白(basic proline rich proteins，PRPs)，以上蛋白分子均被認(rèn)為是防齲蛋白，表達(dá)量與齲病呈負(fù)相關(guān)[19-20]。牙體組織表面的獲得性膜具有獨(dú)特的微生態(tài)環(huán)境包括牙釉質(zhì)表面獲得性膜(acquired enamel pellicle，AEP)和牙本質(zhì)表面獲得性膜(acquired dentine pellicle，ADP)，其蛋白組成動(dòng)態(tài)變化與齲病密切相關(guān)，Delecrode等分別將AEP和ADP暴露于致齲環(huán)境(酸性)并進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，AEP中CSTs超家族分子表達(dá)普遍增加，尤其是胱抑素B，該分子和羥基磷灰石之間具有良好親和力可促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化[21]，而酸蝕后的ADP中則是黏蛋白表現(xiàn)突出，胱抑素B和黏蛋白的增加可能參與抑制脫礦[22]。

致齲菌蛋白表達(dá)與致齲率密切相關(guān)，蛋白組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：糖基轉(zhuǎn)移酶(SMU_833)可促進(jìn)變鏈菌產(chǎn)生突變抗菌素以抑制其他細(xì)菌增強(qiáng)自身抗氧化應(yīng)激能力[23]；谷氨酸消旋酶(MurI)與變鏈菌生物活性密切相關(guān)[24]，SMU_833和MurI表達(dá)增高說(shuō)明變鏈菌表達(dá)活躍。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可與物種間微陣列的聯(lián)合應(yīng)用可用來(lái)研究不同菌株之間的相互代謝作用以探索新的齲病生物標(biāo)記物[25]。生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與排除法蛋白質(zhì)組學(xué)分析(subtractive proteomics analysis)的聯(lián)合應(yīng)用在變鏈菌UA159中發(fā)現(xiàn)了13種致齲相關(guān)蛋白[26]。

2.3 口腔癌

蛋白質(zhì)組學(xué)可用于研究口腔正常組織由癌前病損狀態(tài)(oral premalignant lesions,OPLS)進(jìn)展為癌變組織的差異蛋白表達(dá)，為探索癌變相關(guān)生物標(biāo)記分子發(fā)揮了重要的作用[27]。Ralhan[28]等利用iTRAQ分別將正常組織與OPLS進(jìn)行質(zhì)譜對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)Stratifin、YWHAZ 和異質(zhì)核核糖核蛋白K(hnRNPK)在OPLS中表達(dá)明顯上調(diào)，YWHAZ可直接與核磷蛋白1(NPM1)協(xié)同作用以支持細(xì)胞過(guò)度增殖；Stratifin屬于14-3-3蛋白家族，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)YWHAZ的表達(dá)增高；hnRNPK作為一種RNA結(jié)合酶可直接促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄翻譯、環(huán)氧合酶-2(COX2)激活及P53降解，其作用與炎癥和煙草相關(guān)早期口腔癌有關(guān)，另外，hnRNPK還促進(jìn)了YWHAZ和Stratifin的表達(dá)；3個(gè)分子相互作用模式提示了炎癥與癌癥相關(guān)性，可作為早期判斷OPLS的生物標(biāo)記物候選分子。學(xué)者們利用蛋白組學(xué)技術(shù)陸續(xù)證實(shí)在OPLS組織中蛋白酶激活劑(proteosome activator，PA)同源物PA28a/b/g(2)、S100A7、CD44、S100P、CK10的高表達(dá)是口腔癌預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)記物，某些因子還大量表達(dá)在患者唾液中[29-31]。研究者通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也有發(fā)現(xiàn)：正常角質(zhì)細(xì)胞株和鱗癌細(xì)胞株主要存在5種差異蛋白：膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)、熱休克蛋白27、白介素1受體拮抗劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑clade B5、磷蛋白1以及過(guò)氧化物歧化酶2，其差異表達(dá)可作為鑒定口腔鱗癌細(xì)胞株蛋白譜的初步判斷指征[32]。翻譯后修飾是重要的檢測(cè)指標(biāo)，癌細(xì)胞表面的糖蛋白與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，Chen[33]等對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞和口腔鱗癌細(xì)胞表面的N-聚糖進(jìn)行糖蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)CD147是癌細(xì)胞的關(guān)鍵粘附分子。

2.4 唇腭裂

唇腭裂是常見(jiàn)的顱頜面畸形，臨床修復(fù)難以保證效果，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用將有助于從分子水平研究唇腭裂生物標(biāo)記分子，在孕期進(jìn)行蛋白分子表達(dá)水平可預(yù)測(cè)唇腭裂的發(fā)生率，為早期臨床預(yù)防治療提供理論基礎(chǔ)。有人[34]首次使用“獵槍法”檢測(cè)正常兒童和唇腭裂患兒的蛋白質(zhì)組分，經(jīng)過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)血清中維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)體—視黃醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(RBP4)在患兒血清明顯減少，提示唇腭裂與RBP4和維生素A早期水平有關(guān)；唾液蛋白中修復(fù)相關(guān)蛋白水平顯著增加，包括肌動(dòng)蛋白、胱抑素、角蛋白及真皮因子(dermokine)；此外，促進(jìn)硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)合成的TGF-β3分子表達(dá)水平增高，以誘導(dǎo)CSPGs介導(dǎo)的腭部融合[35]。

3 總結(jié)和展望

蛋白質(zhì)組學(xué)已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的重要組成部分之一，利用該技術(shù)對(duì)牙周炎、齲病等口腔疾病生物標(biāo)記分子進(jìn)行篩查有助于疾病的診斷和防治。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以分別對(duì)口腔組織、血液、唾液等蛋白分子進(jìn)行檢測(cè)，適用范圍廣，檢測(cè)方式多樣，結(jié)果精準(zhǔn)?，F(xiàn)階段由于缺乏對(duì)質(zhì)譜分析結(jié)果的精準(zhǔn)控制和具體的校準(zhǔn)參數(shù)，并且存在蛋白復(fù)合物復(fù)雜度高而難以對(duì)其相互作用進(jìn)行分析等問(wèn)題，目前在臨床運(yùn)用中仍受到限制。