環(huán)境微生物學(xué)教材中微生物分類鑒定教學(xué)內(nèi)容更新的思考

張婷娣 劉 南 任何軍

（吉林大學(xué)新能源與環(huán)境學(xué)院 吉林·長(zhǎng)春 130021）

環(huán)境微生物學(xué)是微生物學(xué)與環(huán)境領(lǐng)域相結(jié)合的新興綜合學(xué)科，是環(huán)境科學(xué)與工程相關(guān)專業(yè)的必修基礎(chǔ)課。環(huán)境微生物學(xué)是以微生物學(xué)的理論與技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)一些環(huán)境現(xiàn)象、環(huán)境質(zhì)量以及環(huán)境問題進(jìn)行研究，主要包括自然環(huán)境中微生物的生長(zhǎng)繁殖、種類分布、結(jié)構(gòu)功能和污染環(huán)境中微生物的功能等內(nèi)容。

目前國內(nèi)高校使用的環(huán)境微生物學(xué)教材主要有以下版本：

（1）樂毅全和王士芬主編的《環(huán)境微生物學(xué)》（化學(xué)工業(yè)出版社，第三版，2019）；

（2）鄭平編著的《環(huán)境微生物學(xué)》（國家精品課程配套教材，浙江大學(xué)出版社，第二版，2020）；

（3）徐威等主編的《環(huán)境微生物學(xué)》（中國建材工業(yè)出版社，2017）；

（4）任何軍和張婷娣主編的《環(huán)境微生物學(xué)》（清華大學(xué)出版社，2015）。

與環(huán)境微生物學(xué)課程相關(guān)的其它重要教材主要有：周德慶編著的《微生物學(xué)教程》（高等教育出版社，第四版，2020）；沈萍和陳向東主編的《微生物學(xué)》（高等教育出版社，第八版，2016）；周群英和王士芬編著的《環(huán)境工程微生物學(xué)》（高等教育出版社，第四版，2015）；林海主編的《環(huán)境工程微生物學(xué)》（冶金工業(yè)出版社，第二版，2014）；王國惠主編的《環(huán)境工程微生物學(xué)——原理與應(yīng)用》（化學(xué)工業(yè)出版社，第三版，2015）；Willey等編寫的英文原版教材《Prescott’s Microbiology》（MC Graw Hill Education出版社，第十版，2017）。《微生物學(xué)》教材側(cè)重微生物基本理論知識(shí)，《環(huán)境工程微生物學(xué)》教材側(cè)重微生物在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用，而《環(huán)境微生物學(xué)》教材則介于《微生物學(xué)》和《環(huán)境工程微生物學(xué)》之間，相關(guān)中文教材的基本框架主要分為兩部分：第一部分是基礎(chǔ)微生物學(xué)內(nèi)容，主要包括微生物學(xué)及顯微鏡的發(fā)展史、微生物的分類與鑒定、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能、微生物的培養(yǎng)、微生物的生長(zhǎng)繁殖與代謝、微生物的遺傳變異和育種、微生物的生態(tài)；第二部分是環(huán)境應(yīng)用微生物部分，主要包括環(huán)境中微生物的分布與檢測(cè)、微生物對(duì)污染物的降解與轉(zhuǎn)化、水污染控制微生物、固體廢物處理微生物、環(huán)境生物技術(shù)等。本論文僅以這些教材為代表，結(jié)合微生物學(xué)發(fā)展史以及現(xiàn)代生命科學(xué)的先進(jìn)研究方法來分析微生物的分類鑒定教學(xué)內(nèi)容。

微生物是一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱。由于微生物形體微小，無法肉眼觀察，導(dǎo)致長(zhǎng)期以來人類對(duì)微生物表現(xiàn)出“視而不見，嗅而不聞，觸而不覺，食而不察，得其益而不感其恩，受其害而不知其惡”的狀態(tài)。直到1676年，荷蘭人安東尼·列文虎克（AntonivanLeeuwenhoek，1632-1723）用其自制的簡(jiǎn)易顯微鏡觀察到了微生物并記錄它們的形態(tài)大小，人類開始進(jìn)入微生物世界的大門。在此初創(chuàng)時(shí)期，微生物的分類鑒定主要是形態(tài)描述。后來法國科學(xué)家路易·巴斯德（Louis Pasteur,182-1895）和德國醫(yī)生羅伯特·科赫（Robert Koch,1843-1910）各自完成了許多與微生物相關(guān)的工作，創(chuàng)立了一整套獨(dú)特的微生物學(xué)基本研究方法，是微生物學(xué)這一學(xué)科的主要奠基人。這一時(shí)期主要從個(gè)體形態(tài)（形態(tài)大小、排列方式、芽孢、運(yùn)動(dòng)性、染色反應(yīng)等）、群體形態(tài)（菌落形態(tài)、半固體或液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)）、生理生化反應(yīng)（營(yíng)養(yǎng)要求、生長(zhǎng)條件、產(chǎn)酶種類、代謝產(chǎn)物、藥物敏感性）、生活史、致病性等方面對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。19世紀(jì)30年代研發(fā)出了電子顯微鏡，從而可以觀察到病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)菌細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。以上指標(biāo)是微生物分類鑒定的經(jīng)典指標(biāo)，一直沿用至今。若用這些經(jīng)典指標(biāo)方法對(duì)未知純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，不僅工作量浩大，還容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。

為了簡(jiǎn)化微生物分類鑒定的步驟，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，很多公司在21世紀(jì)初推出了基于部分經(jīng)典指標(biāo)（主要是生理生化反應(yīng)指標(biāo)）的自動(dòng)化鑒定技術(shù)，比如“API”系統(tǒng)、“Enterotube”系統(tǒng)和“Biolog”系統(tǒng)等。將純種微生物按照系統(tǒng)要求培養(yǎng)后，根據(jù)代謝特征與數(shù)據(jù)庫中的微生物比對(duì)，以初步進(jìn)行分類鑒定。如果該未知純種微生物的代謝特征與數(shù)據(jù)庫中所有微生物都不一致，則無法對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。沃森（J.Watson）和克里克（F.Crick）于1953年發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，微生物學(xué)快速進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)代，因而，大量分子生物學(xué)技術(shù)被用于微生物的分類鑒定，主要包括GC比值、核酸分子雜交法、16S或18SrRNA鑒定、多位點(diǎn)序列分型、基因指紋圖譜等。這些用于微生物分類鑒定的分子生物學(xué)方法主要基于微生物基因組中部分DNA序列的同源性來進(jìn)行鑒定，無法代表微生物基因組的全部特征。目前微生物學(xué)相關(guān)教材都會(huì)對(duì)以上微生物分類鑒定內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)介紹，而對(duì)于最近發(fā)展極為迅速的全基因組測(cè)序技術(shù)在微生物分類鑒定中的作用則不提及或者僅做少量描述。

全基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測(cè)序。獲得任何一個(gè)未知物種的全基因組序列就相當(dāng)于拿到了該物種的唯一“身份證”，從而可以對(duì)其分類鑒定。第一個(gè)完整的生物體基因組全序列是英國科學(xué)家Frederick Sanger于1977年發(fā)表的5386 bp的噬菌體X174全基因組的DNA序列。隨后于1990年正式啟動(dòng)了人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project,HGP），并于2003年完成人類基因組精細(xì)圖。在此期間，完成了大腸桿菌（1997年）和釀酒酵母（1996年）的全基因組序列測(cè)定。從那時(shí)候至2014年之前，完成了上千種微生物全基因組測(cè)序，但是受到測(cè)序技術(shù)的限制，90%以上的微生物基因組為草圖。雖然微生物基因組草圖比前面列舉的用于微生物分類鑒定的分子生物學(xué)方法所比對(duì)的堿基數(shù)量要多一些，結(jié)果也相對(duì)可靠一些，但是由于微生物基因組草圖并不包括基因組全部序列，所以依然很難對(duì)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。近年來，Pacbio研發(fā)出新一代測(cè)序技術(shù)（也稱之為第三代測(cè)序技術(shù)）可以快速獲得純培養(yǎng)微生物的完成圖，并于2014年左右開始全面商業(yè)推廣，目前已經(jīng)基本普及。與以前的測(cè)序技術(shù)相比，該技術(shù)簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確、便宜，且生物信息學(xué)分析更加全面系統(tǒng)。截至目前，微生物基因組完成圖發(fā)表數(shù)量急劇上升。因此，可用于微生物分類鑒定的完成圖數(shù)據(jù)也將更加豐富。

微生物分布廣、數(shù)量多、種類多（除了肉眼可見的后生動(dòng)物、高等植物等之外，絕大部分生物類群都屬于微生物）、雜居混生、易變異，還個(gè)體微小，無法肉眼分辨，因此，微生物的分類鑒定工作一直都是微生物研究的重要方向與難題。除了微生物全基因組序列外的其余鑒定方法或多或少會(huì)受到培養(yǎng)條件、檢測(cè)方法、技術(shù)人員熟練程度、觀測(cè)指標(biāo)等多種因素的影響，很多時(shí)候采用不同鑒定方法會(huì)將同一微生物歸屬于不同類群，給微生物分類帶來很大的麻煩。而每一株微生物的基因組序列是獨(dú)一無二的，因此，獲得了待鑒定微生物的全基因組序列后，可以對(duì)其進(jìn)行精確分類，通過與基因組序列同源性高的其它已知微生物比較，很快就能獲得該菌株的其它性狀，比如運(yùn)動(dòng)性、營(yíng)養(yǎng)要求、致病性、生長(zhǎng)特性等。隨著測(cè)序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展以及已知微生物全基因組序列數(shù)目的飛速增長(zhǎng)，不久微生物的全基因組測(cè)序分析將有可能會(huì)成為微生物分類鑒定的最主要方式。因此，建議微生物學(xué)教材體系中補(bǔ)充更新采用全基因組序列鑒定微生物這一部分內(nèi)容，先簡(jiǎn)單介紹全基因組測(cè)序方法和原理，然后重點(diǎn)介紹微生物基因組組成、全基因組比對(duì)分析方法（比如共線性分析、Core-pan基因分析、基因家族分析、ANI分析法），如何利用全基因組序列進(jìn)行分類鑒定，以及如何獲得鑒定后微生物的其它生理生化性狀等內(nèi)容。此部分內(nèi)容在經(jīng)典的英文原版教材《Prescott’s Microbiology》（MC Graw Hill Education 出版社，第十版，2017）已經(jīng)進(jìn)行了更新。為了與學(xué)科的發(fā)展前沿技術(shù)接軌，因此，建議新編或者改版《環(huán)境微生物學(xué)》教材時(shí)對(duì)此部分內(nèi)容進(jìn)行更新。微生物的分類鑒定是環(huán)境微生物學(xué)教學(xué)和科研的重要組成部分，此部分內(nèi)容究竟如何更新，需要更多的同行或者學(xué)者從不同角度來思考、探索，以促進(jìn)學(xué)生對(duì)該內(nèi)容的掌握。