金光輝，張春雨，張桂芝，李鑫，王鵬程，姜麗麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶 163319）

馬鈴薯食用部分生長于土壤中，形似豆狀[1]，故俗稱土豆，起源于南美洲秘魯?shù)陌驳谒股矫}，是世界第三大主糧作物，具有較高的產(chǎn)量和經(jīng)濟價值。瘡痂病是當前危害馬鈴薯商品薯和種薯且極難防治的世界級土傳病害之一，造成的經(jīng)濟損失巨大。目前，瘡痂病的防治措施有輪作、深翻、施用有機肥等物理防治和使用五氯硝基苯[2]、硫酸鏈霉素和噻菌銅[3]等化學藥劑的化學防治方式，但防治效果并不理想，嚴重影響我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。選育抗病品種是防治瘡痂病最經(jīng)濟有效的措施之一。馬鈴薯瘡痂病是由放線菌科鏈霉菌屬細菌引起的病害，病原菌種類十 分復 雜，S.scabies[4-5]、S.galilaeus[6]、S.acidiscabies[7]、S.turgidiscabies[8]被認為是我國瘡痂病較常見瘡痂病的病原菌，其中普通瘡痂病菌S scabies 最為普遍，近年來在我國大部分主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，部分地區(qū)發(fā)生率達到100%，嚴重影響我國馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了我國馬鈴薯主糧化大面積高效發(fā)展。

植物體表面普遍存在氣孔、水孔和皮孔等可為病原菌提供通道的自然孔口，這些孔口的數(shù)量、大小和結(jié)構(gòu)對植物對病原菌的抵抗能力具有重要影響。關(guān)于植物表皮皮孔與氣孔的研究已有很多報道，木薯葉片氣孔密度影響了細菌性枯萎病的發(fā)病程度[9]。氣孔的密度對植物的抗病性的影響在番茄白粉病等研究中也得到證實[10-11]。在馬鈴薯黑痣病的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病品種的皮孔數(shù)明顯少于感病品種的皮孔數(shù)[12]。目前為止，僅有劉淑娜進行了皮孔數(shù)量對瘡痂病抗性影響的研究，通過4 個品種研究表明，抗性水平較高的馬鈴薯品種的皮孔數(shù)量明顯少于感病品種，仍應(yīng)該繼續(xù)通過對更多的種質(zhì)資源的研究，進一步明確皮孔數(shù)對瘡痂病抗性水平的影響[13]。

我國對馬鈴薯瘡痂病的研究較少，迄今為止，僅有宋志軍[14]、高同國[15]、何虎翼[16]、邢瑩瑩[17]、杜魏甫[18]等幾篇報道，僅對致病菌分離鑒定和抗源的鑒定方面以及病原菌的致病性進行了研究，這些研究僅鑒定出很少高抗性種質(zhì)資源，尚未鑒定出對瘡痂病免疫的種質(zhì)資源，不能滿足我國馬鈴薯的種植以及抗瘡痂病新品種選育的需求，我國馬鈴薯種質(zhì)資源的瘡痂病抗性鑒定工作有待進一步加強。馬鈴薯瘡痂病的研究進展相對緩慢，塊莖表型性狀對馬鈴薯瘡痂病抗性影響的研究未見報道，因此，研究以113 份不同抗性水平的馬鈴薯種質(zhì)資源為試驗材料進行盆栽接種鑒定，以期篩選出具有高水平瘡痂病抗性的種質(zhì)資源，同時對每個種質(zhì)資源的塊莖表型性狀進行統(tǒng)計分析，初步探索馬鈴薯瘡痂病抗性與塊莖表型性狀之間的關(guān)系，有利于馬鈴薯瘡痂病的防治和抗病育種研究，旨為田間育種后代的快速選擇以及抗病基因的發(fā)掘奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株：普通瘡痂病菌S.scabies 的KS28-2 菌株，由黑龍江八一農(nóng)墾大學馬鈴薯研究所保存提供，經(jīng)致病基因分子鑒定、蘿卜苗和馬鈴薯致病性鑒定，該菌株致病性最強，該病菌為黑龍江省馬鈴薯瘡痂病主要病菌之一[17]。

供試種質(zhì)資源：供試馬鈴薯種質(zhì)資源113 份，均來自黑龍江八一農(nóng)墾大學馬鈴薯研究所（詳見表1）。

供試培養(yǎng)基：YME 培養(yǎng)基[17]：瓊脂粉20 g，麥芽浸提物10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于錐形瓶中后高壓蒸汽滅菌。

表1 供試馬鈴薯種質(zhì)資源詳表Table 1 Table of potato germplasm resources used for research

1.2 主要儀器

VS-1300U 型超凈工作臺，PQX-280A-12HM 型生化培養(yǎng)箱，MLS-3781L-PC 型全自動高壓滅菌鍋，F(xiàn)A2004 型電子天平、DMS-653 顯微鏡、血球計數(shù)板（求精醫(yī)用儀器廠）。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 瘡痂病菌培養(yǎng)和接種體制備

在超凈工作臺中，將滅菌好的YME 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用接種環(huán)挑取瘡痂病菌絲，在培養(yǎng)基上以劃線的方式接種。將接種好的YME 培養(yǎng)基放入28 ℃生化培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)，待菌落長滿培養(yǎng)皿平板時，向培養(yǎng)皿中加入無菌蒸餾水，輕輕將菌絲從YME 培養(yǎng)基上輕輕洗下，制成孢子懸浮液。在顯微鏡下利用血球計數(shù)板，對病原菌的孢子數(shù)量進行計數(shù)，將孢子懸浮液的濃度調(diào)整到1×107cfu·ml-1，作為接種體[13]。

1.3.2 盆栽種植與接菌處理

播種前將種薯放在15～20 ℃的自然光下催芽10 d 左右，至芽長0.5 cm 左右。將113 個馬鈴薯種質(zhì)資源于0.1%高錳酸鉀溶液中浸10～15 min，栽培基質(zhì)經(jīng)過121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，采用盆栽種植于溫室內(nèi)，每個種質(zhì)資源種植4 盆，設(shè)置3 盆處理1 盆對照，待盆栽中的小薯大部分長至直徑約2 cm 時，將濃度為1×107cfu·ml-1的孢子懸浮液，采用灌根的方法對盆栽進行接種，每盆接入孢子懸浮液300 mL，對照組加入同等體積無菌蒸餾水。接種后按照正常的馬鈴薯盆栽管理的管理方法進行。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 瘡痂指數(shù)平均值測定方法

瘡痂病的調(diào)查方法和分級標準完全按照劉淑娜[13]的方法進行：每盆單獨收獲后，洗凈塊莖并晾干，計算出每個處理全部塊莖的病斑面積等級均值（MA）和病斑深度等級均值（MD），計算每個種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)平均值（MSI）：根據(jù)公式MSI=（MA×MD）×5，計算瘡痂指數(shù)平均值（MSI）。根據(jù)每個處理的瘡痂指數(shù)平均值（MSI），將馬鈴薯瘡痂病抗性等級劃分為5個等級：

高抗0＜MSI≤6

中抗6＜MSI≤15

感病15＜MSI≤22

高感22＜MSI≤30

重感MSI＞30

表2 病斑面積等級Table 2 Incidence degree of lesion area

表3 病斑深度等級Table 3 Incidence degree of lesion depth

1.4.2 薯型和芽眼深淺測定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]將薯型分為圓形（以品種克新2 號為對照）、橢圓形（以品種克新4 號為對照）和長形（以品種Spunta 為對照），將芽眼類型由淺到深分為淺（以品種中薯3 號為對照）、中（以品種克新4 號為對照）和深（以品種花525 為對照）3 個類型，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的形狀和芽眼類型。

1.4.3 塊莖皮孔數(shù)測定方法

每個處理選擇3 個100 g 左右的健康馬鈴薯塊莖，用直徑為1 cm 的圓形打孔器，分別于馬鈴薯頭部、中部、尾部分別打孔2 次，分別記錄113 份種質(zhì)資源直徑1 cm 面積上塊莖表皮的皮孔個數(shù)，用于后續(xù)分析。

1.4.4 塊莖表皮光滑度測定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]，在收獲當日，隨機選取5 個健康塊莖，觀察表皮光滑程度，按照光滑（光滑，無網(wǎng)紋）、中（較光滑，有網(wǎng)紋）、粗糙（粗糙，重麻皮）三個等級，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的表皮光滑度。

1.4.5 塊莖表皮顏色測定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]，在收獲當日，未經(jīng)陽光曬過，健康塊莖的表皮顏色，按最大相似原則，按照白色、黃色、紅色、紫色4 個標準，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的表皮顏色。

1.4.6 薯肉顏色測定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]，采用1.4.4的材料，在正常光線條件下，切開塊莖，觀察薯肉顏色，按最大相似性原則，將薯肉顏色分為白色、黃色、紅色、紫色4 個標準，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的薯肉顏色。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003 和spss17.0 進行數(shù)據(jù)整理并分析作圖。

表5 馬鈴薯種質(zhì)資源塊莖瘡痂病抗性與部分表型性狀間的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficient between tuber common scab resistance and some phenotypic traits in potato germplasm resources

2 結(jié)果與分析

2.1 不同馬鈴薯種質(zhì)資源對瘡痂病的抗性評價

如表4 所示，全部供試種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)在2.50～39.04 范圍之間，平均瘡痂指數(shù)為14.23，其中瘡痂指數(shù)平均值最小品系為ND17-34-20，最大的為SASSY。不同種質(zhì)資源收獲的塊莖形成的病斑深度和病斑面積均有所不同。其中對瘡痂病表現(xiàn)高抗的種質(zhì)資源有7 份，高抗種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為6.19%，其平均瘡痂指數(shù)為4.13；表現(xiàn)中抗的種質(zhì)資源有67 份，中抗種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為59.29%，其平均瘡痂指數(shù)為10.72；感病的種質(zhì)資源為27 份，感病種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為23.89%，平均瘡痂指數(shù)為18.2；高感的種質(zhì)資源為6 份，高感種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為5.31%，平均瘡痂指數(shù)為23.55；重感的種質(zhì)資源為6 份，比例為5.31%，供試全部種質(zhì)資源的平均瘡痂指數(shù)為34.51。

表4 不同抗性等級的馬鈴薯種質(zhì)資源所占比例Table 4 Proportion of potato germplasm resources with different resistance levels

2.2 馬鈴薯瘡痂病抗性與塊莖部分表型性狀的關(guān)系

相關(guān)性分析表明，馬鈴薯種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)與其塊莖的表皮光滑度存在顯著負相關(guān)關(guān)系，與其塊莖的芽眼類型不具有直線相關(guān)關(guān)系；馬鈴薯瘡痂病抗性等級與其塊莖的薯型和芽眼類型不存在顯著相關(guān)關(guān)系。

2.3 馬鈴薯瘡痂病抗性與塊莖表皮皮孔密度的關(guān)系

為分析馬鈴薯塊莖表皮的皮孔密度對瘡痂病指數(shù)的影響，對113 個馬鈴薯種質(zhì)資源進行相關(guān)性分析，如圖1 所示，結(jié)果表明，瘡痂病指數(shù)平均值隨著塊莖表皮皮孔密度的增加而增加。塊莖表皮皮孔密度與瘡痂指數(shù)平均值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.585 5，回歸方程為y=1.827 4 x-1.579 7，說明塊莖皮孔密度與瘡痂病抗性具有明顯的相關(guān)性，對馬鈴薯瘡痂病的抗性水平具有重要影響。

圖1 不同馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂病指數(shù)與皮孔密度的相關(guān)性Fig.1 Correlation between MSI in different resistant potato germplasm resources and tuber lenticels density

2.4 馬鈴薯塊莖表皮顏色和肉色對瘡痂指數(shù)的影響

根據(jù)圖2 可知，馬鈴薯種質(zhì)資源塊莖的肉質(zhì)顏色對瘡痂指數(shù)的影響具有顯著差異，紫色肉質(zhì)的馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂指數(shù)最大，為15.00，白色肉質(zhì)的馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂指數(shù)最小，為13.48，白色、紅色和黃色肉質(zhì)種質(zhì)資源之間的瘡痂指數(shù)沒有顯著差異，但顯著小于紫色肉質(zhì)的種質(zhì)資源；根據(jù)圖3 可知，紅色表皮和紫色表皮的馬鈴薯種質(zhì)資源塊莖瘡痂指數(shù)較小且沒有顯著差異，白色表皮塊莖的馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂指數(shù)最大，為17.05，說明紅色和紫色塊莖表皮的馬鈴薯種質(zhì)資源對瘡痂病的抗性較高。

圖2 不同種質(zhì)資源塊莖肉質(zhì)顏色對瘡痂指數(shù)的影響Fig.2 Effects of tuber fleshy color on MSI in different germplasm resources

圖3 不同種質(zhì)資源塊莖表皮顏色對瘡痂指數(shù)的影響Fig.3 Effects of tuber skin color on MSI in different germplasm resources

3 討論

不同種質(zhì)資源對瘡痂病具有不用的抗性水平，在113 份種質(zhì)資源中，僅篩選ND17-34-20、ND17-12-12、ND17-4-7 和11-1-38 等7 份高抗種質(zhì)資源，占全部種質(zhì)資源的6%，宋志軍等[14]在20 份高世代馬鈴薯種質(zhì)資源中篩選得到2 份高抗類型種質(zhì)資源，并指出可以通過SSR 遺傳相似性系數(shù)大致區(qū)分抗病類型和感病類型，何虎翼等[17]在36 份馬鈴薯種質(zhì)資源在田間自然瘡痂病圃中鑒定出2 份高抗種質(zhì)資源，目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)具有免疫瘡痂病菌特性的馬鈴薯種質(zhì)資源。由此可見，具有高水平瘡痂病抗性的種質(zhì)資源較難獲得，據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有保存種質(zhì)資源1 700 余份（不包括野生種和原始栽培種）[20]，因此目前被鑒定的種質(zhì)資源數(shù)量相對較少，仍需要加大力度對現(xiàn)有種質(zhì)資源加以利用和新種質(zhì)資源的開發(fā)，優(yōu)異的抗病品種是提升馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的有力支撐。

在植物與病原菌的互作過程中，馬鈴薯塊莖表皮的皮孔是用于氣體交換的孔道，排列疏松得補充組織可以使病原菌相對容易的侵染植物[21]。研究表明，瘡痂指數(shù)與塊莖表皮單位面積皮孔數(shù)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明單位面積皮孔數(shù)量是影響馬鈴薯瘡痂病抗性的重要指標之一。國外報道中指出，一些瘡痂病抗性較強的馬鈴薯種質(zhì)資源，塊莖表皮皮孔數(shù)具有較少的特點[22]，這與研究結(jié)論基本一致。研究僅針對馬鈴薯塊莖表皮的皮孔密度與瘡痂病抗性的關(guān)系進行了初步研究，但是在以往的研究中，植物皮孔大小、性狀以及組織結(jié)構(gòu)等特性同樣對植物的抗病性具有重要影響，因此以后將針對馬鈴薯皮孔特性繼續(xù)開展更加系統(tǒng)的研究。

植物表皮是植物與外界直接接觸的最外層細胞，是植物避免生物危害的第一道屏障，在馬鈴薯黑痣病抗性影響結(jié)構(gòu)因素的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲容易侵染表皮粗糙，裂縫多且深的馬鈴薯塊莖[12]，在研究中，馬鈴薯塊莖同樣表現(xiàn)出表皮光滑的馬鈴薯種質(zhì)資源，瘡痂指數(shù)較小，繼而瘡痂病的抗性水平越高，抗病水平與表皮光滑程度存在顯著正相關(guān)關(guān)系。在馬鈴薯瘡痂病高發(fā)地區(qū)，可以優(yōu)先選擇表皮光滑型品種，抗性水平較高的種質(zhì)資源的利用有利于降低馬鈴薯瘡痂病發(fā)生率與嚴重程度，防止因瘡痂病造成的馬鈴薯商品價值降低，降低馬鈴薯種植的風險。研究表明，塊莖表皮光滑程度可以作為評價瘡痂病抗性的一個重要指標，可以對新培育的種質(zhì)資源進行瘡痂病抗性綜合評價，對培育具有良好推廣價值的抗病新品種具有重要意義。

馬鈴薯塊莖是有匍匐莖尖端膨大形成的一個縮短而肥大的變態(tài)莖，因品種的不同，馬鈴薯塊莖表皮有白、黃、紫、褐、黑等不同顏色，塊莖肉質(zhì)也有白、黃、紅、紫色等之分，Waterer 通過嵌合體材料研究馬鈴薯塊莖顏色與瘡痂病抗性的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，紅色表皮具有更高的瘡痂病的抗性水平，認為瘡痂病抗性基因與表皮顏色表達基因是連鎖的[23]，研究表明，紅色和紫色表皮的馬鈴薯種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)明顯小于黃色和白色表皮種質(zhì)資源，在皮色對瘡痂病抗性的影響上與前人產(chǎn)生了類似的結(jié)論。紫色肉質(zhì)種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)明顯高于白、黃和紅色種質(zhì)資源，由于表皮顏色和肉質(zhì)顏色是由遺傳因素決定的，同時不同肉色馬鈴薯塊莖含有的酚類物質(zhì)和抗氧化能力均具有明顯差異[24]，深入研究馬鈴薯塊莖瘡痂病的抗病影響因素，有利于揭示馬鈴薯瘡痂病的抗病機制，對瘡痂病的科學防治和理論研究具有重要意義。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，通過對113 份馬鈴薯種質(zhì)資源的鑒定以及表皮皮孔數(shù)量、表皮光滑度和皮色肉色等表型性狀的初步研究，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂病抗性與塊莖表表型性狀具有較大的關(guān)聯(lián)性，可以為馬鈴薯抗瘡痂病育種提供一定的參考。寄主與病原菌相互作用是一個非常復雜的過程，影響寄主抗病性的結(jié)構(gòu)和生理生化指標還有很多，在以后的研究中可以適當增加種質(zhì)資源的數(shù)量，對接種后的表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化指標進行測定，進一步完善馬鈴薯瘡痂病結(jié)構(gòu)特征以及生理生化與抗病性的關(guān)系，為馬鈴薯抗病育種提供科學依據(jù)。