邱 煒，陳義烘

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽 550025; 2. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

對蝦是最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，為世界糧食安全和經(jīng)濟(jì)增長做出了重大貢獻(xiàn)[1]，對蝦在我國水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)品種養(yǎng)殖中占有重要的地位. 對蝦養(yǎng)殖品種有凡納濱對蝦 (Litopenaeusvannamei)、日本囊對蝦 (Penaeusjaponicus) 及斑節(jié)對蝦 (Penaeusmonodon) 等，其中L.vannamei是最主要的養(yǎng)殖品種. 隨著對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，尤其是高密度養(yǎng)殖模式帶來的養(yǎng)殖環(huán)境惡化，導(dǎo)致對蝦病害發(fā)生頻繁，嚴(yán)重制約了對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展. 病毒、真菌、細(xì)菌、寄生蟲等都能導(dǎo)致對蝦發(fā)病，其中白斑綜合癥病毒 (White Spot Syndrome Virus，WSSV)引起的白斑綜合癥 (White Spot Syndrome, WSS) 危害大、致死率高，是目前威脅對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的最主要病害[2-3]. 因此對WSSV復(fù)制機(jī)理的研究，能夠?yàn)閷ξrWSS的防治提供理論基礎(chǔ).

凝集素 (Lectin) 是一類特異性識(shí)別糖基并與之非共價(jià)、可逆地結(jié)合的蛋白質(zhì), 其廣泛存在于動(dòng)物和植物[4]. 在研究凝集素的歷史中，人們對凝集素的研究主要集中在高等植物，而對甲殼動(dòng)物凝集素的研究較少. 甲殼動(dòng)物缺乏免疫球蛋白，不具有特異性免疫反應(yīng)，但卻以獨(dú)特的方式抵抗病原體的侵襲. 凝集素在甲殼動(dòng)物非特異性免疫中發(fā)揮重要功能，其一般存在于血淋巴細(xì)胞中，具有類似于免疫球蛋白的作用[5-6]. 動(dòng)物凝集素可分為多類，主要包括：C型凝集素 (C-Type Lectin，CTL)、F型凝集素、I型凝集素和P型凝集素等[6]. 目前已知，凡納濱對蝦CTL1 (LvCTL1) 重組蛋白對WSSV 表現(xiàn)出特異的親和力，并且具有抑制WSSV復(fù)制功能[7]. 為了進(jìn)一步了解LvCTL1與WSSV復(fù)制的關(guān)系，本文主要研究了體內(nèi)條件下WSSV感染對LvCTL1表達(dá)的影響及LvCTL1表達(dá)對WSSV復(fù)制的影響，研究結(jié)果能為L.vannamei的WSS防控提供了更多理論知識(shí).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 雙鏈RNA的制備

使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega公司，美國)試劑盒體外合成雙鏈RNA (dsRNA)[8]. 合成dsRNA所用引物序列見表1.

表1 所用引物序列Table 1 The primer sequences

1.2 WSSV的制備

將WSSV感染的L.vanname肌肉 (0.1 g) 切碎，然后在1 mL 1×PBS緩沖液 (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4) 中勻漿，4 ℃條件下5 000 g離心10 min后，將上清液通過0.45 μm膜過濾后獲得病毒原液. 使用絕對定量PCR定量病毒拷貝數(shù) (操作方法見1.4).

1.3 RNA干擾 (RNAi) 與WSSV感染

按1 μg/g的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別肌肉注射合成的dsRNA. dsRNA用PBS稀釋，注射量為50 μL/尾. dsRNA注射后24、72、120、168 h，分別采集不同實(shí)驗(yàn)組9尾蝦的鰓組織. 另外采集相同來源的未經(jīng)任何處理的9條蝦鰓組織作為0 h的樣品. 每3條蝦鰓組織混合在一起存于RNAlater?(Ambion公司，美國)，作為一個(gè)樣本. 用相對定量PCR法檢測基因表達(dá)結(jié)果 (操作方法見1.4).

對蝦注射dsRNA 后48 h再注射WSSV (105拷貝數(shù)/尾). dsRNA和WSSV用PBS稀釋，注射量為50 μL/尾. 在注射WSSV后24、48、72、120 h，分別采集不同實(shí)驗(yàn)組9尾蝦的鰓和肌肉組織. 另外采集相同來源的未經(jīng)任何處理的9尾蝦作為0 h樣品. 每3尾蝦混合在一起作為一個(gè)樣本. 鰓組織存于RNAlater?中，室溫下放置1 h或4 ℃過夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存. 肌肉組織直接放入-80 ℃保存.

1.4 絕對和相對定量PCR檢測

采用Taqman探針法檢測L.vanname肌肉病毒拷貝數(shù)[8]. WSV069引物和TaqMan熒光探針序列見表1. 以含有來自WSSV基因WSV069片段pMD19-T質(zhì)粒作為內(nèi)參. 使用基因組DNA提取試劑盒Ver.3.0 (TaKaRa公司，日本) 從肌肉中提取基因組DNA. 提取的DNA模板和內(nèi)參質(zhì)粒進(jìn)行絕對qPCR，其程序?yàn)?5 ℃ 8 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 25 s和72 ℃ 1 s條件循環(huán)40次. 每個(gè)樣本進(jìn)行3次絕對qPCR重復(fù)實(shí)驗(yàn).

相對qPCR實(shí)驗(yàn)用于檢測基因相對表達(dá)量. RNeasy Mini Kit (Qiagen公司，德國) 提取蝦鰓的總RNA后，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司，中國) 將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 按照SYBR?Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus，TaKaRa，日本)說明書進(jìn)行相對qPCR實(shí)驗(yàn)，其程序?yàn)?5 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s和78 ℃ 1 s條件循環(huán)40次. 每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)相對qPCR實(shí)驗(yàn). 使用5倍稀釋法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算引物擴(kuò)增效率. LvCTL1、VP28和LvEF-1α擴(kuò)增效率分別是 1.902、1.986和1.959. 實(shí)驗(yàn)用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因表達(dá)的差異[9]. 所用引物序列如表1所示.

1.5 組織病理學(xué)分析

注射dsRNA后48 h再注射WSSV (105拷貝數(shù)/尾). WSSV注射48、72、120 h后取蝦的頭胸部用AFA溶液固定，固定24 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇長久保存. 制作石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色[10-11]. 每個(gè)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別選擇3尾蝦制作成9張切片，計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇的3張切片(每尾蝦1張)的總細(xì)胞數(shù)和感染細(xì)胞數(shù)，計(jì)算感染細(xì)胞數(shù)所占比例.

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算3個(gè)樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差 (SD). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (X±SD) 的形式表示. 使用student’st檢驗(yàn)比較2個(gè)平均值之間的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 注射dsLvCTL1能顯著抑制LvCTLl表達(dá)

相對qPCR檢測結(jié)果顯示，注射dsLvCTL1后24～168 h，LvCTL1的表達(dá)顯著下調(diào) (P<0.05) (圖1A).

雖然在24 h檢測點(diǎn)基因表達(dá)已經(jīng)有明顯的下調(diào)，然而蛋白水平的下調(diào)在mRNA下調(diào)之后，所以選擇注射dsRNA后48 h再注射WSSV. WSSV感染后，對L.vannamei鰓中LvCTL1的表達(dá)進(jìn)行了檢測 (圖1B). 與0 h相比，LvCTL1的表達(dá)在所有檢測點(diǎn)都顯著上調(diào) (P<0.01)，提示LvCTL1可能在WSSV復(fù)制中具有重要功能. 感染后，注射dsLvCTL1也能顯著抑制LvCTL1的表達(dá) (圖1B)，表明在WSSV刺激顯著上調(diào)情況下注射dsLvCTL1也能有效發(fā)揮其抑制作用.

圖1 蝦鰓組織中LvCTL1表達(dá)水平的檢測

2.2 LvCTLl在WSSV復(fù)制中的功能

膜囊蛋白VP28是對蝦的主要致病蛋白之一，在WSSV感染過程中起決定性作用[12-13]. 結(jié)果顯示：在所有檢測時(shí)間點(diǎn)中dsLvCTL1+WSSV組的VP28表達(dá)量(圖2A) 和WSSV拷貝數(shù)(圖2B)都高于dsEGFP+WSSV對照組，表明活體內(nèi)LvCTL1起到抑制WSSV復(fù)制的功能.

為了進(jìn)一步確認(rèn)LvCTLl在WSSV復(fù)制中的作用，做了組織病理學(xué)分析. 在每個(gè)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，來源于 3 尾蝦的3張胃上皮細(xì)胞切片圖被分析 (由于這3張切片結(jié)果是相似的，所以圖3僅顯示了1張切片圖) . 結(jié)果顯示：dsLvCTL1與dsEGFP對照組在WSSV感染后48、72、120 h的感染細(xì)胞比分別是44.7%與37.7%、56.2%與48.8%和80.0%與56.3%，該結(jié)果進(jìn)一步確定活體內(nèi)LvCTL1起到抑制WSSV復(fù)制的功能.

CLT是一種重要的先天性免疫因子，在抗感染中能識(shí)別病原體，其在對蝦機(jī)體的免疫防御中具有重要的作用[6-7]. 目前已知，重組LvCTL1蛋白對WSSV 表現(xiàn)出特異的親和力，且具有一定的抑制WSSV復(fù)制功能[7]，這表明LvCTL1在WSSV復(fù)制的過程中的可能具有重要作用. 為了進(jìn)一步確認(rèn)LvCTL1功能，本研究進(jìn)行了活體RNAi實(shí)驗(yàn). 結(jié)果顯示:干擾LvCTL1表達(dá)后WSSV復(fù)制增加，這就說明LvCTL1在活體條件下起到抑制WSSV復(fù)制的功能. 上述結(jié)果顯示：利用LvCTL1在WSSV復(fù)制中的重要作用研制出相應(yīng)的免疫防治策略應(yīng)用于白斑綜合癥的防治可能是一種可行的途徑.

圖2 經(jīng)dsLvCTL1處理并感染W(wǎng)SSV的蝦體內(nèi)病毒感染水平檢測

圖3 感染W(wǎng)SSV對蝦胃上皮細(xì)胞的組織病理分析

2.3 核因子-κB上調(diào)LvCTL1的表達(dá)

核因子-κB (Nuclear Factor-Kappa B, NF-κB)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在機(jī)體的免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡等重要病理和生理過程中發(fā)揮重要的作用[14-15]. 然而，多種病毒卻能激活進(jìn)而利用宿主NF-κB來復(fù)制自己. 例如在被艾滋病毒1感染的細(xì)胞中，NF-κB被激活，然后增加長末端重復(fù)序列 (LTR) 驅(qū)動(dòng)的病毒復(fù)制[16-17]. 激活的NF-κB通過作用于異嗜性小鼠白血病病毒相關(guān)病毒LTR 上的NF-κB位點(diǎn)，進(jìn)而增加病毒的復(fù)制[18]. 在L.vannamei中，已鑒定出2個(gè)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子：LvDorsal和LvRelish[19-20].

本實(shí)驗(yàn)的檢測樣本來源于課題組以前的保存樣本，其結(jié)果已經(jīng)表明dsLvDorsal和dsLvRelish能分別有效抑制LvDorsal和LvRelish的表達(dá)[8]. 在本實(shí)驗(yàn)所有檢測時(shí)間點(diǎn)，敲降LvDorsal和LvRelish后LvCTL1表達(dá)都被抑制 (圖4)，表明LvDorsal和LvRelish能上調(diào)LvCTL1的表達(dá). 結(jié)果顯示W(wǎng)SSV感染后，機(jī)體通過LvDorsal和LvRelish上調(diào)LvCTL1表達(dá)進(jìn)而抑制WSSV復(fù)制. 目前已知WSSV感染能顯著激活LvDorsal和LvRelish的表達(dá)，并利用它們來復(fù)制自己[8]. 綜合這些結(jié)果分析表明：L.vannamei中機(jī)體免疫與WSSV復(fù)制存在一個(gè)動(dòng)態(tài)關(guān)系，提示W(wǎng)SSV感染后，L.vannamei機(jī)體啟動(dòng)免疫防御系統(tǒng)來抑制WSSV復(fù)制，而WSSV卻利用機(jī)體免疫系統(tǒng)來復(fù)制自己.

圖4 LvNF-κB對LvCTL1表達(dá)水平的影響

3 結(jié)論

WSSV感染后，L.vannamei機(jī)體可通過NF-κB上調(diào)LvCTL1表達(dá). LvCTL1表達(dá)上調(diào)能抑制WSSV的膜囊蛋白VP28表達(dá)、病毒拷貝數(shù)和胃上皮細(xì)胞中的感染細(xì)胞數(shù). 這些結(jié)果表明WSSV感染后，L.vannamei機(jī)體通過上調(diào)LvCTL1表達(dá)來抑制WSSV復(fù)制.