石海旺，段 銳，劉承宜

(華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣州 510006)

骨骼肌萎縮是由于去神經(jīng)支配、損傷、關(guān)節(jié)固定、長(zhǎng)期臥床休息、衰老以及癌癥惡病質(zhì)等相關(guān)因素引起的骨骼肌質(zhì)量的下降[1]. 骨骼肌質(zhì)量變化取決于骨骼肌相關(guān)蛋白質(zhì)的合成與降解之間的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，一旦平衡關(guān)系被打破，骨骼肌合成與降解之間出現(xiàn)失衡，將導(dǎo)致骨骼肌萎縮或骨骼肌的非正常肥大[2]. 在一般人群中，骨骼肌萎縮常見(jiàn)于廢用性，這種狀態(tài)會(huì)使骨骼肌由于外界刺激減少導(dǎo)致骨骼肌蛋白質(zhì)合成速率下降，使骨骼肌纖維橫截面積下降及纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)變[2]. 骨骼肌的生長(zhǎng)和萎縮主要取決于磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase, PI3K)的活性，它是哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)[3-4]，通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)IGF1-PI3K-Akt/PKB-mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，增加骨骼肌質(zhì)量[5]. 骨骼肌蛋白質(zhì)降解途徑主要由泛素-蛋白酶體(Ubiquitin-Proteasome System，UPS)和自噬-溶酶體(Autophagy-Lysosome Pathway, ALP)2種途徑介導(dǎo)[6]. 其中Muscle RING Finger 1(MURF1)和 Muscle Atrophy F-Box(MAFbx) 是骨骼肌和心肌特異性的2種E3泛素蛋白連接酶[7]，在骨骼肌萎縮過(guò)程中發(fā)揮重要作用. 叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead Box O, FOXO)是已知的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)因子，F(xiàn)OXO3活化足以引起肌肉質(zhì)量的劇烈減少[8-9]，另一個(gè)促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵因子是肌肉生長(zhǎng)抑制素，肌肉生長(zhǎng)抑制素是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)家族成員，是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素會(huì)促進(jìn)骨骼肌肥大，增加骨骼肌質(zhì)量[10].

從20世紀(jì)60年代開(kāi)始，電刺激進(jìn)入醫(yī)療保健相關(guān)領(lǐng)域，包括各種物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)等. 其中，骨骼肌電刺激(Muscle Electrical Stimulation，MES)被廣泛用于增加骨骼肌質(zhì)量和纖維橫截面積，防治由于長(zhǎng)期臥床或者處于失重狀態(tài)下的廢用性肌萎縮[11]，然后逐漸發(fā)展成為預(yù)防骨骼肌萎縮的有效干預(yù)方式[12]. MES主要分為高頻電刺激(High Frequency Electrical Stimulation，HFES )和低頻電刺激(Low Frequency Electrical Stimulation，LFES )，其中LFES可以預(yù)防并減少?gòu)U用性骨骼肌質(zhì)量丟失；HFES可以維持骨骼肌張力、增加肌肉質(zhì)量以及骨骼肌纖維橫截面積[2,13-15].

本研究在常重力和微重力2種環(huán)境中進(jìn)行習(xí)慣性電刺激，模擬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練處理大鼠后肢腓腸肌、比目魚(yú)肌以及脛骨前肌，然后使用改進(jìn)尾懸吊法(Tail Suspension，TS)[16]模擬微重力環(huán)境，觀察各組肌肉的萎縮情況；在此基礎(chǔ)之上，引入聯(lián)合訓(xùn)練機(jī)制，即在常重力和微重力環(huán)境中分別通過(guò)高頻電刺激(HFES)和低頻電刺激(LFES)及相互結(jié)合的方式對(duì)大鼠進(jìn)行聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)，篩選最佳延緩骨骼肌萎縮的方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用56只雄性SPF級(jí)8周齡的斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague-Dawley, SD)大鼠，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041，飼養(yǎng)在華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)房，室內(nèi)溫度22±2 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～60%之間，12 h/12 h晝夜交換，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的作息規(guī)律，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作息時(shí)間明暗交替，飼養(yǎng)房通風(fēng)條件良好，于普通飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)2周之后開(kāi)始干預(yù).

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)階段. 第1階段，在常重力環(huán)境下探討HFES和LFES干預(yù)6周對(duì)正常SD大鼠骨骼肌的影響；第2階段，用TS模擬微重力，根據(jù)第1階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采取干預(yù)效果較好的高頻電刺激進(jìn)行微重力干預(yù)(Control and then TS Plus HFES intervention, Group C)和常重力干預(yù)(HFES for 6 weeks and then TS intervention, Group HT)，探討不同干預(yù)階段對(duì)延緩骨骼肌萎縮的效果；第3階段：引入聯(lián)合訓(xùn)煉機(jī)制，在常重力和微重力環(huán)境中使用持續(xù)HFES與LFES或聯(lián)合干預(yù)的鍛煉模式，探討最佳抵抗/延緩骨骼肌萎縮的方法. 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)表1.

表1 實(shí)驗(yàn)分組Table 1 The experimental group

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建方法 尾懸吊(Tail Suspension，TS)是一種模擬失重使大鼠后肢骨骼肌萎縮的實(shí)驗(yàn)方法[16]，將實(shí)驗(yàn)大鼠用固定器固定，限制其活動(dòng)，使尾部外露，先用肥皂水清洗其尾部表面，再?lài)娡康饩撇⒋蹈?，以防止壓敏膠布對(duì)大鼠尾部產(chǎn)生過(guò)度刺激，同時(shí)，肥皂水和碘酒可以使大鼠尾部皮膚表面變澀，使膠布粘貼更加牢固. 使用壓敏膠布從大鼠一側(cè)尾根部起，按縱向走形，將一長(zhǎng)約17～20 cm的醫(yī)用壓敏膠布，粘貼于尾部表面至距尾尖部3～5 cm處，使用醫(yī)用紗布纏繞大鼠尾部，然后在此段尾部的表面，依次間斷地纏繞3～4圈橫向膠條，以對(duì)縱向的粘貼位置進(jìn)行加固. 利用懸吊梁上的細(xì)鐵鏈與掛鉤調(diào)整大鼠頭低位，使其軀體與鼠籠底部呈30°，最后將大鼠懸吊至鼠籠內(nèi)的懸吊梁上，大鼠在懸吊期間可以利用前肢自由活動(dòng)，飲食和飲水均不受限制(圖1). 懸吊8周后，體質(zhì)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異.

圖1 SD大鼠尾部懸吊示意圖

1.3.2 骨骼肌電刺激 使用購(gòu)自美國(guó)Artisan Technology Group S48 Stimulator電刺激儀(圖2)和220 V穩(wěn)壓電源，通過(guò)導(dǎo)線(xiàn)連接Hwato(華佗)牌0.3×25 mm的非一次性針灸針. 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，為了避免大鼠在電刺激過(guò)程中抵抗由于刺激引發(fā)的非自愿收縮以及由于掙扎導(dǎo)致的骨骼肌其他損傷和應(yīng)激，使用3.5%的水合氯醛，按照7 μL/g的麻醉劑量麻醉大鼠，在大鼠進(jìn)行刺激當(dāng)日，防止大鼠由于麻醉原因，腸道蠕動(dòng)頻率下降進(jìn)而導(dǎo)致腸梗阻，所以在刺激前晚對(duì)大鼠進(jìn)行禁食不禁水處理. 待大鼠麻醉后，使用脫毛膏清理大鼠腿部毛發(fā)，使用酒精棉擦拭大鼠腿部和針灸針，使大鼠側(cè)臥于平面，將電針扎入將要刺激的后肢骨骼肌(圖3). 骨骼肌電刺激參數(shù)見(jiàn)表2.

表2 骨骼肌電刺激參數(shù)Table 2 The muscle electrical stimulation parameters

圖2 S48電刺激儀

圖3 骨骼肌電刺激示意圖

1.3.3 實(shí)驗(yàn)取材 電刺激結(jié)束次日，以7.5%的水合氯醛麻醉大鼠，然后取大鼠左側(cè)后肢腓腸肌(Left Gastrocnemius，LG)、左側(cè)脛骨前肌(Left Tibialis，LT)、左側(cè)比目魚(yú)肌(Left Soleus，LS)，稱(chēng)取完整各骨骼肌質(zhì)量并記錄，將兩側(cè)骨骼肌肌腹部分剪下，用做冰凍切片樣品. 其余部分進(jìn)行分裝，以備蛋白表達(dá)情況檢測(cè).

1.3.4 冰凍切片及蘇木素-伊紅染色 首先，使用黃芪膠適量，放在紙板上面做固定底托，肌肉使用吸水紙除去表面水份，將骨骼肌肌腹部分垂直立入黃芪膠底托，使黃芪膠可以充分地固定樣本. 將盛放異戊烷的小燒杯放入盛有液氮的保溫桶中，液氮的液面維持在異戊烷液面的1/3處，預(yù)冷之后，將骨骼肌樣本迅速投入異戊烷中30～60 s，然后取出放入液氮中備用. 使用德國(guó)徠卡冰凍切片機(jī)將骨骼肌樣本切成6～10 μm的切片，制片，進(jìn)行蘇木素伊紅(Hematoxylin-Eosin Staining ,HE)染色，觀察骨骼肌形態(tài)以及骨骼肌橫截面積的變化.

1.3.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)-Western Blot 使用100～200 mg腓腸肌樣品剪碎放入離心管，加入裂解液和鋼珠，使用上海凈信科技公司的全自動(dòng)樣品快速研磨儀60 Hz勻漿60～120 s，然后使用高速冷凍離心機(jī)(4 ℃)、12 000 r/min離心10 min，取上清液；使用10 μL 用于測(cè)定蛋白濃度，其余樣品按照4∶1的比例加入5×Loading Buffer，然后在100 ℃水溫中煮10 min，待冷卻至室溫后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備用. 使用Cell Signaling Technology(CST)的p70s6k、P-p70s6k、Akt以及P-Akt蛋白抗體，GAPDH作為內(nèi)參，分別檢測(cè)不同蛋白的表達(dá)量.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.4.1 Sigma算法 本研究在傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法的基礎(chǔ)上引入Sigma算法[17-18]對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì). Sigma算法建立在自然界普遍存在的冪函數(shù)分布[19]或?qū)?shù)函數(shù)分布[20]的基礎(chǔ)上，其主要包括定量差異統(tǒng)計(jì)[21]與自相似算法[18,22]. 定量差異閾值用(α,β,γ)表示，其中α為Weber閾值，定量差異小于α定義為完全沒(méi)有差異，β和γ為顯著性閾值. 不同水平的差異閾值不同，整體水平、組織器官水平以及細(xì)胞分子水平功能的差異性閾值分別為(0.100 6,0.268 3,0.472 2)、(0.161 0,0.472 2,0.804 8)和(0.268 3,0.804 8,1.221 0)[21,23]. 自相似算法包括一階自相似算法和高階自相似算法. 通過(guò)計(jì)算2組數(shù)據(jù)的定量差異或者空間比值的定量差異，與顯著性閾值β比較，判斷2組數(shù)據(jù)的自相似水平.

1.4.2 傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用GraphPad Prism7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)(Mean,M)±標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Error, SD)表示為M±SD. SD大鼠骨骼肌質(zhì)量以及組間差異均采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Sigma算法統(tǒng)計(jì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共有10組，每組參數(shù)指標(biāo)為5個(gè)，其中，組織器官水平參數(shù)包括腓腸肌質(zhì)量(mLG)、脛骨前肌質(zhì)量(mLT)以及比目魚(yú)肌質(zhì)量(mLS)，分子水平使用磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白的比值表征蛋白質(zhì)的激活程度，a-Akt表示P-Akt與Akt的比值，a-p70s6k表示P-p70s6k與p70s6k的比值. 經(jīng)過(guò)Sigma算法計(jì)算10個(gè)組兩兩滿(mǎn)足自相似. 表3列出了各干預(yù)組與Z組參數(shù)指標(biāo)之間的比值均值和整體定量差異. 由于參數(shù)組包括組織器官水平參數(shù)和分子水平參數(shù)，所以其最大顯著性閾值β為0.804 8. 表3結(jié)果顯示：H組的整體定量差異為0.848，大于顯著性閾值β，所以H組與Z組屬于升級(jí)自相似，其他各干預(yù)組的整體定量差異均小于0.804 8，表示與Z組屬于同級(jí)自相似.

不同頻率電刺激對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子表達(dá)的影響不同，其中長(zhǎng)期HFES可以增加抗阻訓(xùn)練正則通路“Akt-mTOR-p70s6k”的激活程度，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成增加，使骨骼肌肥大以延緩由于失重而導(dǎo)致的廢用性骨骼肌萎縮[18,24]. 本研究選擇其中的Akt以及p70s6k的蛋白激活程度作為分子水平參數(shù)，其自相似計(jì)算結(jié)果如表4所示. 骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度為分子水平，其顯著性閾值β為0.804 8，經(jīng)過(guò)干預(yù)之后，僅T組的整體定量差異小于0.804 8，其他各干預(yù)組的整體定量差異均大于0.804 8，表明骨骼肌電刺激可以激活并逐漸形成抗阻訓(xùn)練的正則通路，以延緩骨骼肌萎縮. 表4還表明：正常飼養(yǎng)環(huán)境中，HFES干預(yù)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度好于LFES干預(yù)；微重力環(huán)境中高頻電刺激對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度好于常重力環(huán)境高頻電刺激；聯(lián)合組中LLT組對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度好于其他各組.

表3 各干預(yù)組與健康對(duì)照組參數(shù)指標(biāo)的比值均值和整體定量差異Table 3 The mean ratio and overall quantitative difference of the parameter of each intervention group and the healthy control group

表4 各干預(yù)組與健康對(duì)照組的分子水平比值均值和整體定量差異

2.2 傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2.1 不同頻率干預(yù)對(duì)骨骼肌的影響

(1)骨骼肌質(zhì)量 經(jīng)過(guò)HFES和LFES干預(yù)6周之后，骨骼肌質(zhì)量都出現(xiàn)了不同程度的上升(表5)，H組與Z組相比，HFES干預(yù)6周后，大鼠比目魚(yú)肌質(zhì)量(mLS)提高21%(P<0.05)，脛骨前肌質(zhì)量(mLT)提高27%(P<0.01)，腓腸肌質(zhì)量(mLG)提高18%. LFES干預(yù)6周，大鼠后肢骨骼肌質(zhì)量雖有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異.

表5 不同頻率干預(yù)對(duì)骨骼肌質(zhì)量的影響

(2)HE染色結(jié)果 通過(guò)6周的電刺激，Z組的骨骼肌纖維形態(tài)比較飽滿(mǎn)圓潤(rùn)，肌纖維之間有少量基質(zhì)存在(圖4). 相比較而言，H組和L組的骨骼肌纖維形態(tài)存在向多邊形改變的變化趨勢(shì)，且骨骼肌纖維橫截面積顯著增加.

(3)蛋白免疫印跡結(jié)果 使用蛋白免疫印跡方法(Western Blot，WB)測(cè)定大鼠脛骨前肌中Akt和P-Akt以及p70s6k和P-p70s6k的蛋白表達(dá)量. 根據(jù)骨骼肌蛋白質(zhì)合成因子的激活程度判斷HFES和LFES對(duì)促進(jìn)骨骼肌肥大的效果(圖5).

圖5 不同頻率干預(yù)的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)6周不同頻率的骨骼肌電刺激干預(yù)，骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子Akt和p70s6k的表達(dá)量明顯增加(表6)，與Z組相比，H組Akt蛋白激活程度提升110%(P<0.01)，p70s6k蛋白激活程度提升98%(P<0.01)；L組Akt蛋白激活程度提升74%(P<0.01)，p70s6k蛋白激活程度提升114%(P<0.01). 說(shuō)明不同頻率MES可能是通過(guò)促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成使骨骼肌肥大，HFES干預(yù)效果與LFES干預(yù)無(wú)顯著性差異.

2.2.2 常重力和微重力干預(yù)對(duì)抵抗骨骼肌萎縮效果的比較 根據(jù)第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HFES干預(yù)6周可以顯著增加骨骼肌質(zhì)量，促進(jìn)相關(guān)蛋白Akt及p70s6k的表達(dá)與激活，因此選用HFES的干預(yù)形式，探討在常重力環(huán)境和微重力環(huán)境中進(jìn)行干預(yù)，延緩骨骼肌萎縮的效果.

表6 不同頻率干預(yù)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度

(1)骨骼肌質(zhì)量 尾懸吊模擬失重干預(yù)4周后，大鼠后肢骨骼肌出現(xiàn)萎縮，主要是以慢肌纖維為主的比目魚(yú)肌萎縮最為嚴(yán)重(表7)，與Z組相比，T組比目魚(yú)肌質(zhì)量(mLS)下降45%(P<0.01). 經(jīng)過(guò)常/微重力干預(yù)后，比目魚(yú)肌質(zhì)量下降得到明顯的緩解，C組與T組相比，比目魚(yú)肌質(zhì)量增加23%；HT組比目魚(yú)肌質(zhì)量增加48%(P<0.01)，表示常重力干預(yù)效果好于微重力干預(yù). 以快肌纖維為主的脛骨前肌(mLT)和腓腸肌(mLG)無(wú)顯著差異.

表7 常/微重力干預(yù)對(duì)骨骼肌質(zhì)量的影響

(2) HE染色結(jié)果 經(jīng)過(guò)4周的尾懸吊干預(yù)(圖6)，可以發(fā)現(xiàn)T組骨骼肌纖維形態(tài)發(fā)生改變，骨骼肌纖維橫截面積顯著縮小，經(jīng)過(guò)常/微重力高頻電刺激干預(yù)后，可以減緩這種縮小的趨勢(shì)，并且C組的干預(yù)效果比HT組稍好.

圖6 常/微重力干預(yù)的腓腸肌HE染色結(jié)果

(3)蛋白免疫印跡結(jié)果 經(jīng)過(guò)4周尾懸吊處理之后，大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子Akt和p70s6k的表達(dá)明顯下降(圖7)，蛋白質(zhì)合成速率降低，導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量下降. 常/微重力高頻電刺激干預(yù)后，相關(guān)蛋白表達(dá)降低的趨勢(shì)有所緩解，其中，經(jīng)過(guò)C組和HT組干預(yù)之后p70s6k的蛋白表達(dá)明顯高于T組，具有顯著性差異.

圖7 常/微重力干預(yù)的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同時(shí)期的骨骼肌電刺激都可以通過(guò)上調(diào)相關(guān)蛋白質(zhì)合成因子的表達(dá)促進(jìn)骨骼肌質(zhì)量的增加(表8). 與T組相比，C組Akt蛋白激活程度增加51%，p70s6k蛋白激活程度增加80%(P<0.01)；HT組Akt蛋白激活程度增加24%，p70s6k蛋白激活程度增加79%(P<0.01). C組與HT組無(wú)顯著差異.

表8 常/微重力干預(yù)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度

2.2.3 聯(lián)合干預(yù)對(duì)抵抗骨骼肌萎縮的效果 前人的研究主要集中在骨骼肌萎縮發(fā)生之前或者恢復(fù)期間，以探討不同時(shí)期干預(yù)對(duì)抵抗骨骼肌萎縮或加速骨骼肌萎縮恢復(fù)的效果，但缺乏對(duì)骨骼肌萎縮發(fā)生前與發(fā)展過(guò)程中采取相同或不同的干預(yù)模式進(jìn)行聯(lián)合訓(xùn)練的研究. 本實(shí)驗(yàn)借鑒高原訓(xùn)練理論引入聯(lián)合訓(xùn)練模式，采用HFES與LFES相結(jié)合的干預(yù)方法，旨在探討更加有效的干預(yù)模式與干預(yù)次序，為抵抗由于廢用性導(dǎo)致的骨骼肌萎縮提供更好的方法，同時(shí)，驗(yàn)證維持習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)形式是否具有更好的延緩骨骼肌萎縮的效果.

(1)骨骼肌質(zhì)量 經(jīng)過(guò)聯(lián)合訓(xùn)練模式，聯(lián)合組各干預(yù)模式對(duì)延緩骨骼肌萎縮都有明顯效果(表9). HHT組與T組相比，比目魚(yú)肌質(zhì)量(mLS)提高55%(P<0.01)，脛骨前肌質(zhì)量(mLT)提升37%(P<0.01)，腓腸肌質(zhì)量(mLG)提升25%(P<0.01)；HLT組與T組相比，比目魚(yú)肌質(zhì)量提升62%(P<0.01)，脛骨前肌質(zhì)量提升3.6%，腓腸肌質(zhì)量提升11%；LLT組與T組相比，比目魚(yú)肌質(zhì)量提升59%(P<0.01)，脛骨前肌質(zhì)量下降9%，腓腸肌質(zhì)量下降6%；LHT組與T組相比，比目魚(yú)肌質(zhì)量提升58%，脛骨前肌質(zhì)量提升26%(P<0.05). 綜上所述，HHT組的綜合干預(yù)效果好于其他各干預(yù)模式，可以明顯抵抗由于尾懸吊導(dǎo)致的廢用性骨骼肌萎縮.

表9 聯(lián)合干預(yù)對(duì)骨骼肌質(zhì)量影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

(2) HE染色結(jié)果 聯(lián)合訓(xùn)練模式大鼠腓腸肌HE染色結(jié)果如圖8所示，經(jīng)過(guò)10周的長(zhǎng)期骨骼肌電刺激干預(yù)之后，改善了由于尾懸吊導(dǎo)致的骨骼肌萎縮，并且與T組相比，聯(lián)合組干預(yù)后骨骼肌間基質(zhì)明顯減少，相同視野下肌纖維數(shù)量下降，表明各骨骼肌纖維面積增加，且持續(xù)使用HFES的干預(yù)效果要好于其他各組.

圖8 聯(lián)合干預(yù)組的腓腸肌HE染色結(jié)果

(3)蛋白免疫印跡結(jié)果 通過(guò)聯(lián)合訓(xùn)練模式干預(yù)，發(fā)現(xiàn)不同的干預(yù)模式對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)信號(hào)因子的影響不同(圖9). 聯(lián)合訓(xùn)練模式各干預(yù)組與T組相比，均可以激活A(yù)kt以及p70s6k的蛋白表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，抵抗由于尾懸吊而導(dǎo)致的廢用性骨骼肌萎縮.

圖9 聯(lián)合干預(yù)組的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在聯(lián)合訓(xùn)練模式干預(yù)過(guò)程中，LLT組與T組相比(表10)，Akt的蛋白激活程度提升79%(P<0.05)，p70s6k的蛋白激活程度提升79%(P<0.01). LLT組對(duì)Akt及p70s6k的蛋白激活程度好于其他各種干預(yù)形式，同時(shí)驗(yàn)證維持習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)通路的激活程度好于非習(xí)慣性運(yùn)動(dòng).

表10 聯(lián)合干預(yù)組對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的激活程度

3 討論

骨骼肌萎縮主要表現(xiàn)為肌纖維橫截面積減小、蛋白質(zhì)合成速率下降、肌肉力量減小、肌纖維類(lèi)型根據(jù)不同的萎縮類(lèi)型發(fā)生不同的轉(zhuǎn)化[25]. 前人研究發(fā)現(xiàn)：使用50 Hz電針對(duì)后肢石膏固定C57BL/6小鼠進(jìn)行為期2周的干預(yù)，可以顯著增加小鼠骨骼肌纖維橫截面積[26]. EKEN等[11]發(fā)現(xiàn)維持骨骼肌質(zhì)量的有效刺激方案為：每周3次，每天2組，每組30 min，強(qiáng)度為0.4～30 mA的刺激方案效果最佳. 使用質(zhì)量濃度為25 mg/ml的紅景天苷[27]以及銀杏葉提取物FGB761[28]灌胃治療的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FOXO3的磷酸化水平升高，骨骼肌萎縮程度得到明顯抑制. 所以,目前針對(duì)骨骼肌萎縮的主要治療方法包括藥物以及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給、物理康復(fù)治療以及運(yùn)動(dòng)干預(yù)，且研究重點(diǎn)主要集中在骨骼肌萎縮發(fā)生的恢復(fù)期，鮮有研究探討前期習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)對(duì)抵抗骨骼肌萎縮的效果及其機(jī)制. 本研究在TS干預(yù)前對(duì)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期骨骼肌電刺激，不但發(fā)現(xiàn)了有效的骨骼肌電刺激模式，而且發(fā)現(xiàn)了維持習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)比非習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)具有更好的抵抗骨骼肌萎縮的效果，對(duì)于開(kāi)發(fā)太空長(zhǎng)期滯留的應(yīng)用技術(shù)具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值.

4 結(jié)論

本研究探討了不同條件下骨骼肌電刺激對(duì)尾懸吊導(dǎo)致大鼠骨骼肌萎縮的抵抗效果. 通過(guò)對(duì)骨骼肌質(zhì)量、骨骼肌纖維形態(tài)變化特征以及相關(guān)蛋白表達(dá)與激活程度，探討有效的骨骼肌電刺激干預(yù)頻率、干預(yù)階段與干預(yù)形式，為抵抗骨骼肌萎縮提供一定的理論基礎(chǔ)及指導(dǎo). 結(jié)合Sigma算法與傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得出結(jié)論：

(1)尾懸吊干預(yù)4周，大鼠比目魚(yú)肌質(zhì)量下降45%，骨骼肌纖維直徑顯著縮小，Akt、p70s6k蛋白激活程度顯著降低. 而不同頻率骨骼肌電刺激可以促進(jìn)正常飼養(yǎng)大鼠Akt、p70s6k的蛋白表達(dá)以促進(jìn)骨骼肌質(zhì)量及骨骼肌纖維直徑的增加.

(2)常/微重力環(huán)境中，高頻電刺激干預(yù)使骨骼肌萎縮得到不同程度的改善. 懸吊前干預(yù)，比目魚(yú)肌質(zhì)量與T組相比提升49%，已基本恢復(fù)至正常水平.

(3)聯(lián)合訓(xùn)練模式中，習(xí)慣性高頻電刺激干預(yù)模式的綜合干預(yù)效果好于其他干預(yù)模式，HHT組骨骼肌質(zhì)量與T組相比均提高20%以上，其中比目魚(yú)肌質(zhì)量提高55%，顯著高于其他各干預(yù)組. 而習(xí)慣性低頻電刺激組Akt與p70s6k的激活程度與T組相比均提高79%，表明習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)骨骼肌相關(guān)蛋白的表達(dá)，以維持骨骼肌質(zhì)量.