李武峰，孫瑜彤，趙婧微，李樹(shù)軍

廣靈驢基因的克隆和序列分析與組織表達(dá)

李武峰1，孫瑜彤1，趙婧微1，李樹(shù)軍2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山西 太谷 030801；2.繁峙縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西 繁峙 034300)

運(yùn)用RT-PCR方法，克隆廣靈驢的基因的CDS區(qū)，對(duì)其進(jìn)行序列分析，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)鑒定基因在廣靈驢心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明：廣靈驢基因完整的CDS序列全長(zhǎng)為2 223 bp，可編碼740個(gè)氨基酸，序列已提交到NCBI，登錄號(hào)為MN_166472，其核苷酸序列與馬的核苷酸序列的同源性最高，達(dá)99.6%；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ADD1蛋白為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的親水性蛋白，理論等電點(diǎn)為5.58，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，存在1個(gè)Ⅱ類醛縮酶和內(nèi)收蛋白N端超家族結(jié)構(gòu)域，該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽及跨膜區(qū)域，主要定位在細(xì)胞核中，序列中共存在88個(gè)磷酸化位點(diǎn)，69個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，基因在廣靈驢的6種組織中均有表達(dá)，但存在差異，在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最豐富，在肝臟中表達(dá)量最低。

廣靈驢；基因；克隆；生物信息學(xué)分析；差異表達(dá)

內(nèi)收蛋白(adducin，ADD)是由α、β和γ 3個(gè)不同亞基組成的異二聚體或異四聚體蛋白[1-2]，是構(gòu)成血影蛋白的膜骨架的重要部分，可以介導(dǎo)各種細(xì)胞生理過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。內(nèi)收蛋白家族包括3個(gè)密切相關(guān)的成員，分別是α-內(nèi)收蛋白(ADD1)、β-內(nèi)收蛋白(ADD2)及γ-內(nèi)收蛋白(ADD3)[3-4]，其中ADD1和ADD3在大多數(shù)組織中表達(dá)，而ADD2的表達(dá)受到了限制，主要在腦和造血組織(骨髓、脾)中大量表達(dá)[5-6]。3種內(nèi)收蛋白在結(jié)構(gòu)上相似，都包含有一個(gè)N末端球狀頭部結(jié)構(gòu)、一個(gè)頸部結(jié)構(gòu)和一個(gè)C末端蛋白酶敏感性尾部結(jié)構(gòu)[7-8]。ADD1是內(nèi)收蛋白家族的重要成員，在細(xì)胞的增殖、連接、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遷移和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等方面具有重要作用，是細(xì)胞發(fā)生作用的信號(hào)傳遞因子[9-12]?；蚩梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和腎小管細(xì)胞基底外側(cè)鈉-鉀ATP酶的表達(dá)來(lái)影響鈉平衡，從而對(duì)鹽敏感性高血壓有影響[13-14]；在利尿劑的作用下，基因多態(tài)性也可能會(huì)引發(fā)糖尿病[15]。另外，基因在有絲分裂和減數(shù)分裂中也發(fā)揮了重要的作用[16-17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，ADD1和α2-Na/K ATP酶的蛋白復(fù)合體在星形膠質(zhì)細(xì)胞中富集，會(huì)導(dǎo)致家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥，從而對(duì)肌肉發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。欒德琴[19]的研究表明，基因在皋黃雞幼齡時(shí)的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了積極的作用。基因多態(tài)性也能夠影響肉牛的生長(zhǎng)性狀和肌肉發(fā)育[20]，可用于肉牛育種計(jì)劃的標(biāo)記輔助選擇。

廣靈驢是中國(guó)優(yōu)良的地方品種，主要分布于山西省東北部廣靈、靈邱及其周圍各縣的邊緣地帶。廣靈驢肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)肉驢基因的克隆及其在不同組織中的差異表達(dá)卻鮮有報(bào)道。本研究中，選取基因作為目的基因，利用RTPCR技術(shù)對(duì)廣靈驢基因CDS編碼區(qū)進(jìn)行克隆，并對(duì)其核酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，檢測(cè)基因在廣靈驢各個(gè)組織中的表達(dá)水平，旨在為今后探索基因所參與的生理功能提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

供試廣靈驢由山西省忻州市繁峙縣田源毛驢養(yǎng)殖科技發(fā)展有限公司提供。用無(wú)菌方式采集10頭3歲飼養(yǎng)方式相同、健康公驢的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和背最長(zhǎng)肌組織作為試驗(yàn)樣本，分別放入2 mL凍存管中，并立即凍于液氮里，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室后放于-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.1.2主要試劑

大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pGM-T克隆試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker、2×PCR Master Mix均購(gòu)于中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M5 Super qPCR RT kit with gDNA remove)、熒光定量試劑盒(2×Realtime PCR Super mix)購(gòu)于北京聚合美生物科技有限公司；Trizol試劑盒、氨芐青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物及瓊脂糖均購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI中公布的驢基因序列(登錄號(hào)為XM_014832815)，利用Primer 3.0和GenScript Primer Design分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增廣靈驢基因CDS區(qū)序列的4對(duì)擴(kuò)增引物和1對(duì)熒光定量PCR的特異性引物，并將作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1　用于擴(kuò)增ADD1基因的引物信息

1.2.2總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法提取廣靈驢心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和背最長(zhǎng)肌的總RNA，并使用核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量，之后按照M5 Super qPCR RT kit with gDNA remove反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束獲得的cDNA模板于-20 ℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序

以cDNA第一條鏈為模板，擴(kuò)增基因全長(zhǎng)CDS區(qū)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)為：cDNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后得到4段長(zhǎng)度不同、可重疊的擴(kuò)增產(chǎn)物；確定產(chǎn)物后，對(duì)目的條帶進(jìn)行回收；連接pGM-T載體，過(guò)夜后轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)涂板、挑取單克隆、擴(kuò)大培養(yǎng)后，再利用PCR篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，最后交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.2.4序列分析

運(yùn)用NCBI和DNAMMAN 6.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，拼接，并進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)；采用Clustalx和DNASTAR中的MegAlign程序?qū)V靈驢與馬、人、豬、山羊、綿羊、家牛、小鼠的基因核苷酸序列和蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)、同源性分析，并使用MEGA 7.0構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用ExPASy ProtParam、ProtScal分別對(duì)ADD1蛋白的氨基酸組成、不穩(wěn)定系數(shù)等基本理化性質(zhì)和親/疏水性進(jìn)行分析；采用NPS@SOPMA、SWISS-MODEL和NCBI中的CDD(Conserved domain database)對(duì)ADD1蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢測(cè)分析；運(yùn)用SignaIP 5.0、TMHMM 2.0和PSORT II Prediction分別對(duì)ADD1蛋白的信號(hào)肽、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及ADD1蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行檢測(cè)分析；運(yùn)用NetPhos 3.1 Server、NetNGlyc 1.0及NetOGlyc 1.0 Server分別對(duì)ADD1蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行鑒別分析。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

以1.2.2中合成的cDNA為模板，并把背最長(zhǎng)肌組織的表達(dá)量作為對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因在廣靈驢6種組織中的相對(duì)表達(dá)情況。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)并有相應(yīng)內(nèi)參組。擴(kuò)增完成后，利用2-△△Ct法計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果。運(yùn)用SPSS 24.0對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并利用Excel繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　廣靈驢ADD1基因的序列

將廣靈驢基因的CDS區(qū)按表1中的所列引物分為4段擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度為584、779、922、692 bp的4個(gè)片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如圖1所示，4段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)雜帶，條帶明亮，電泳片段大小與預(yù)期估計(jì)的片段大小相符。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序拼接后得到一段長(zhǎng)度為2 223 bp的mRNA序列，將序列提交至NCBI(GenBank登錄號(hào)為MN_166472)，可編碼740個(gè)氨基酸(圖2)。

M　DNA Marker；1~4分別為引物ADD1-1、ADD1-2、ADD1-3和ADD1-4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2　廣靈驢ADD1基因的測(cè)序結(jié)果

2.2　廣靈驢ADD1基因及其編碼蛋白序列的同源性比對(duì)分析結(jié)果

運(yùn)用MegAlign軟件將廣靈驢基因與GenBank中已提交的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)廣靈驢基因與馬(XM_014738607.2)、人(NM_001119.5)、豬(XM_013978492.2)、山羊(XM_018049844.1)、綿羊(XM_027971285.1)、家牛(XM_005208231.3)、小鼠(NM_001331084.1)的同源性分別為99.5%、91.6%、88.1%、89.3%、88.8%、85.1%和84.4%。

使用MegAlign軟件將廣靈驢ADD1蛋白序列與GenBank中已提交的蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)廣靈驢ADD1蛋白與馬(XP_014594093.1)、人(NP_001110.2)、豬(XP_013833946.2)、山羊(XP_017905333.1)、綿羊(XP_027827086.1)、家牛(XP_005208289.1)、小鼠(NP_001019629.2)的同源性分別為99.6%、93.7%、92.1%、94.3%、93.6%、94.0%和91.7%。

2.3　ADD1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

采用MEGA 7.0中N-J法構(gòu)建廣靈驢的基因核苷酸序列與馬、人、豬、山羊、綿羊、家牛、小鼠的基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。從圖3可知，廣靈驢與馬聚為1類，說(shuō)明廣靈驢與馬的親緣關(guān)系最近，同時(shí)又與綿羊、山羊、家牛和豬聚為1大類，與人和小鼠的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。

圖3　ADD1基因核苷酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4　廣靈驢ADD1蛋白分子特征的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4.1氨基酸序列的理化性質(zhì)和親/疏水性

廣靈驢基因編碼的蛋白質(zhì)ADD1蛋白分子式為C3556H5628N994O1132S22，理論相對(duì)分子質(zhì)量為8.112×104，理論等電點(diǎn)(pI)為5.58，不穩(wěn)定指數(shù)為54.69?？梢?jiàn)，此蛋白是酸性不穩(wěn)定的，其編碼的740個(gè)氨基酸中谷氨酸含量(8.9%)和脯氨酸含量(8.8%)較多，色氨酸含量(0.5%)最低，消光系數(shù)為53 665，脂溶指數(shù)為69.85。如圖4所示，廣靈驢ADD1蛋白的部分序列有強(qiáng)親水性，ADD1多肽鏈的第184位脯氨酸(P)具有最大疏水性(2.633)，第443位精氨酸(R)具有最大親水性(-3.500)，親水性的總平均值為-0.649，該蛋白為可溶性蛋白。

圖4　ADD1蛋白親/疏水性分析結(jié)果

2.4.2ADD1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

如圖5所示，ADD1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占33.11%，延伸鏈占14.32%，β-轉(zhuǎn)角占4.73%，無(wú)規(guī)則卷曲占47.84%。

h　a-螺旋；c　無(wú)規(guī)則卷曲；t　β-轉(zhuǎn)角；e　延伸鏈。

如圖6所示，ADD1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

圖6　ADD1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4.3ADD1蛋白的保守域

如圖7所示，ADD1蛋白只含有1個(gè)Ⅱ類醛縮酶和內(nèi)收蛋白N端超家族結(jié)構(gòu)域(Aldolase_Ⅱ superfamily)，位于第145~392殘基上。

圖7　ADD1蛋白的保守域預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4.4ADD1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位

如圖8所示，ADD1蛋白在膜外的可能性高于膜內(nèi)，并且整條序列沒(méi)有明顯的跨膜區(qū)域，說(shuō)明該蛋白為膜外蛋白。

圖8　ADD1蛋白的跨膜區(qū)域分析結(jié)果

如圖9所示，值、值及值的最大值均小于閾值0.5，表明ADD1蛋白沒(méi)有信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)，屬于非分泌蛋白。

C值、S值、Y值分別示C切割位點(diǎn)評(píng)分、S信號(hào)肽評(píng)分和Y聯(lián)合切割位點(diǎn)評(píng)分。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，ADD1蛋白分布于液泡和細(xì)胞質(zhì)的可能性都為4.3%，分布于細(xì)胞核的可能性為91.3%，預(yù)測(cè)可信度為89%，該蛋白有可能存在于細(xì)胞核中。

2.4.5ADD1蛋白的修飾結(jié)構(gòu)

如圖10所示，ADD1蛋白共存在88個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包含54個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、23個(gè)蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)、11個(gè)酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)(圖10-a)；ADD1蛋白中存在69個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其中，3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)分別位于氨基酸序列的84、118和463處(圖10-b)。

圖10　ADD1蛋白的磷酸化位點(diǎn)(a)和N-糖基化位點(diǎn)(b)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5　ADD1基因在廣靈驢不同組織中的表達(dá)情況

如圖11所示，基因在廣靈驢6種組織中均有表達(dá)，但存在差異；在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)最豐富，其表達(dá)量極顯著高于其他5種組織的(< 0.01)；在心臟的表達(dá)量極顯著高于肺臟、腎臟和脾臟中的(< 0.01)；在肝臟中的表達(dá)量最低，其表達(dá)量極顯著低于其他5種組織的(<0.01)。

不同小寫(xiě)字母示組織間差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母示組織間差異極顯著(P<0.01)。

3　結(jié)論與討論

本研究成功克隆了廣靈驢基因完整的CDS編碼區(qū)，并對(duì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)基因在廣靈驢不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。廣靈驢基因CDS編碼區(qū)全長(zhǎng)為2 223 bp，可編碼740個(gè)氨基酸，序列已提交至NCBI(GenBank登錄號(hào)為MN_166472)。通過(guò)對(duì)廣靈驢基因核苷酸序列和蛋白序列與其他物種相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，廣靈驢基因核苷酸序列與其他物種的同源性在84%以上，蛋白序列與其他物種的同源性在91%以上，說(shuō)明基因不僅在不同物種之間的進(jìn)化比較保守，而且在不同物種中能夠保持結(jié)構(gòu)和功能的一致性?；蛳到y(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，廣靈驢與馬的親緣關(guān)系最近，同處于一個(gè)遺傳進(jìn)化分支上，與人、小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說(shuō)明在某些核苷酸序列上廣靈驢與馬的屬性更接近，這符合生物進(jìn)化的特征。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析顯示，廣靈驢ADD1蛋白為不穩(wěn)定酸性蛋白，部分序列有強(qiáng)親水性，且整體表現(xiàn)為親水性。在蛋白質(zhì)中，疏水性殘基一般位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，而親水殘基一般位于蛋白質(zhì)的表面[21]，預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明了ADD1蛋白質(zhì)表面的親水性殘基要多于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADD1蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲的比例最高，約占47.84%，進(jìn)一步說(shuō)明ADD1蛋白為不穩(wěn)定蛋白。無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體/受體結(jié)合的活性部位，易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象[22]；因此，ADD1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中大量的無(wú)規(guī)則卷曲可能與蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能密切相關(guān)。ADD1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，與該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。蛋白保守功能域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADD1蛋白中存在著1個(gè)Ⅱ類醛縮酶和內(nèi)收蛋白N端超家族結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域具有寡聚化位點(diǎn)，有助于ADD1形成異二聚體和異四聚體結(jié)構(gòu)[23]。

信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADD1蛋白沒(méi)有信號(hào)肽區(qū)域，表明ADD1不屬于分泌蛋白，不能夠在細(xì)胞外起作用。跨膜預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADD1無(wú)跨膜蛋白，不能發(fā)生跨膜現(xiàn)象，說(shuō)明該蛋白不能作為膜受體來(lái)發(fā)揮作用。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，有91.3%的ADD1蛋白存在于細(xì)胞核中，預(yù)測(cè)該蛋白可能在核內(nèi)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，ADD1在失去細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附后會(huì)移位至細(xì)胞核中，因而ADD1可能存在核特異性功能，這與預(yù)測(cè)的結(jié)果相符合。蛋白質(zhì)在翻譯后經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)男揎棧艜?huì)形成成熟蛋白質(zhì)，其中磷酸化修飾和糖基化修飾是非常重要的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)磷酸化修飾是控制酶活性的關(guān)鍵，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程中也起非常重要的作用[26]。蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，ADD1蛋白存在88個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可以判斷ADD1蛋白在參與生物學(xué)功能的過(guò)程中或與其他蛋白發(fā)生相互作用的時(shí)候可能會(huì)被磷酸化。此外，ADD1蛋白還存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)，這也為其參與多種細(xì)胞機(jī)制，包括蛋白質(zhì)折疊、受體激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程打下了基礎(chǔ)[27]。

JOSHI等[3]研究表明，基因在人類腎臟和腦中的表達(dá)量要高于肝臟和脾臟；楊娟娟[28]研究表明，基因在肉雞的心臟、大腦、垂體、下丘腦、腎臟和腿肌等組織中有較高的表達(dá)量，但是有關(guān)基因在背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)情況卻鮮有報(bào)道。本研究中，廣靈驢基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和背最長(zhǎng)肌中均有表達(dá)，但存在差異，在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)最豐富，在肝臟中的表達(dá)量最低，推測(cè)基因與廣靈驢的肌肉發(fā)育具有一定的相關(guān)性，這與楊娟娟[28]的結(jié)果并不沖突，表明基因在不同物種中的表達(dá)可能具有差異性。關(guān)于基因與廣靈驢肌肉發(fā)育之間的關(guān)系以及其具體的功能尚不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。

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Cloning, sequence analysis and tissue expression ofgene of Guangling donkey

LI Wufeng1, SUN Yutong1, ZHAO Jingwei1, LI Shujun2

(1.School of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China; 2.Fanshi County Animal Epidemic Prevention and Control Center, Fansi, Shanxi 034300, China)

The CDS region ofgene of Guangling donkey was cloned by RT-PCR method, and followed with sequence analysis. qRT-PCR was used to identify the relative expression level ofgene in heart, liver, spleen, lung, kidney and longissimus dorsi muscle. The results showed that the complete CDS sequence of Guangling donkeygene was 2 223 bp in length and could encode 740 amino acids. The sequence was submitted to NCBI with the login number MN_166472, and its nucleotide sequence had the highest homology with the horse nucleotide sequence, up to 99.6%. Bioinformatics prediction ADD1 protein had stable hydrophilic protein structure, theory of isoelectric point was 5.58, the secondary structure was mainly α-helix and random coils, and there was a Aldolase_Ⅱsuperfamily domain in the protein sequence. The protein had no signal peptide and transmembrane region, and was mainly located in the cell nucleus. There were 88 phosphorylation sites, 69 O-glycosylation sites and 3 N-glycosylation sites in the sequence. The results of real-time fluorescence quantitative detection showed thatgene was expressed in all studied 6 tissues, but there were differences in expression. The expression ofgene was the most abundant in longissimus dorsi muscle and the lowest in liver.

Guangling donkey;gene; cloning; bioinformatics analysis; differential expression

S822.2

A

1007-1032(2020)05-0733-09

李武峰，孫瑜彤，趙婧微，李樹(shù)軍．廣靈驢基因的克隆和序列分析與組織表達(dá)[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(6)：733-741．

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http://xb.hunau.edu.cn

2019-10-24

2019-11-07

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(指南)項(xiàng)目(201803D421022)

李武峰(1967—)，男，博士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，leewf1967@163.com

10.13331/j.cnki.jhau.2020.0 .015

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正