朱明媛，劉 靜，李艷玲，董建偉，黃 韜，李 潤(rùn)

(唐山怡安生物工程有限公司，河北唐山 063020)

犬細(xì)小病毒病(Canine parvovirus disease，CPVD)是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一種急性高度接觸性傳染病，與病犬接觸后100%感染，致死率高達(dá)70%[1]。該病既嚴(yán)重威脅家養(yǎng)寵物的健康，又對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)構(gòu)成較大危害。犬細(xì)小病毒病目前沒(méi)有特效藥物，除依靠動(dòng)物自身的免疫系統(tǒng)抵抗外，接種疫苗是預(yù)防犬細(xì)小病毒感染的最有效方法?；钜呙纭缁钜呙?、弱毒疫苗均有報(bào)道能一定程度預(yù)防犬細(xì)小病毒病[2-4]，目前國(guó)內(nèi)常用弱毒疫苗預(yù)防犬細(xì)小病毒病，但弱毒疫苗通常因母源抗體干擾發(fā)生免疫失敗，接種后動(dòng)物可長(zhǎng)期排毒，存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。犬細(xì)小滅活疫苗具備免疫原性而不具有致病性，接種后動(dòng)物能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，達(dá)到保護(hù)作用，越來(lái)越受到科研工作者的青睞，但制備滅活疫苗對(duì)抗原的滴度要求很高，所以獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量的抗原是實(shí)現(xiàn)犬細(xì)小滅活疫苗產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。

目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的獲得犬細(xì)小病毒的方法主要有轉(zhuǎn)瓶法、雞胚法，鮮見(jiàn)有利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)犬細(xì)小病毒的報(bào)道。傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝培養(yǎng)病毒普遍存在病毒滴度低、批間差大、勞動(dòng)力成本高、易污染等問(wèn)題[5-6]，因此找到一種新的培養(yǎng)犬細(xì)小病毒的方法頗為急切。本文利用微型生物反應(yīng)器及NBS反應(yīng)器摸索培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳工藝，并將利用該工藝生產(chǎn)的抗原同傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品做對(duì)比，以期為犬細(xì)小病毒的高產(chǎn)、高質(zhì)培養(yǎng)提供一種新的可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 F81細(xì)胞，唐山怡安生物工程有限公司馴化、保藏；犬細(xì)小病毒YA-16-C66株，唐山怡安生物工程有限公司篩選、保藏。

1.1.2 主要溶液與試劑 199培養(yǎng)基，天信合生物科技有限公司；新生牛血清，武漢三利生物科技有限公司；β-丙內(nèi)酯(BPL)，德國(guó)SERVA；MONTANIDE GEL 02，賽彼科(上海)特殊化學(xué)品有限公司。

1.1.3 載體 聚酯纖維紙片載體，上海楚怡生物科技有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 微型轉(zhuǎn)管生物反應(yīng)器，杭州安普生物工程有限公司；CO2培養(yǎng)箱，三洋MCO-15AC；BioFlo 310型生物反應(yīng)器(5L)，美國(guó)NBS生物工程公司；SBA生化分析儀，濟(jì)南延和生物科技有限公司。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 比格犬，北京瑪斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 F81細(xì)胞的最佳接種密度確定 利用微型生物反應(yīng)器，內(nèi)含0.6 g聚酯纖維紙片載體。培養(yǎng)條件為：37.0 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為1%新生牛血清的199培養(yǎng)基，分別按照0.5×107/g、1.5×107/g、2.5×107/g密度接種細(xì)胞。每個(gè)密度平行設(shè)置9支。為了確保細(xì)胞增殖不受營(yíng)養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的影響，培養(yǎng)基每24 h更換一次，并測(cè)定殘?zhí)菨舛取Ｃ?4 h取一支轉(zhuǎn)管，將載體用0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)，分析細(xì)胞密度與葡萄糖消耗之間的關(guān)系。

1.2.2 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量確定 利用微型生物反應(yīng)器，以1.5×107/g密度接種細(xì)胞，同時(shí)以不同感染復(fù)數(shù)(MOIs：0.05、0.1、0.2、0.4)接種病毒。每個(gè)接毒劑量平行設(shè)置9支，將微型反應(yīng)器置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接毒后每24 h完全換液，測(cè)定葡萄糖消耗和上清液的病毒含量TCID50，TCID50測(cè)定方法參照《中國(guó)獸藥典》[7]。每24 h取一支轉(zhuǎn)管，將載體用0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)，直到紙片載體上細(xì)胞幾乎全部脫落時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。結(jié)合病毒含量和細(xì)胞病變情況，確定犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量。

1.2.3 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化 按照工藝流程，將150 g紙片載體裝入5L NBS生物反應(yīng)器中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。將生長(zhǎng)成良好致密單層的F81細(xì)胞制成懸液，以1.5×107/g密度接種，犬細(xì)小病毒YA-16-C66株用培養(yǎng)基稀釋后，以感染復(fù)數(shù)0.05 MOI接種。培養(yǎng)基為含1%新生牛血清的199培養(yǎng)基，培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置為37 ℃，pH7.2，溶氧50%，攪拌速度50 r/min，24 h后開(kāi)啟灌流。1#反應(yīng)器溫度維持在37.0 ℃；2#反應(yīng)器培養(yǎng)溫度在接種細(xì)胞48 h后降至35.0 ℃。24 h開(kāi)始每天取樣測(cè)定葡萄糖消耗，根據(jù)糖耗及細(xì)胞病變清情況調(diào)整灌流速度，使反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖濃度控制在0.5 g/L以上。48 h開(kāi)始收獲并每天測(cè)定病毒含量TCID50，直到紙片載體上細(xì)胞幾乎全部脫落時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，測(cè)定總病毒含量TCID50。經(jīng)過(guò)3批次驗(yàn)證，比較兩種不同溫度培養(yǎng)對(duì)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株產(chǎn)毒質(zhì)量的影響，確定利用F81細(xì)胞生產(chǎn)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株的紙片載體培養(yǎng)工藝。

1.2.4 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株工藝比較

1.2.4.1 紙片載體培養(yǎng)工藝 按照1.2.3確定的工藝，在5L生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)3批病毒。當(dāng)糖耗降低，紙片載體上細(xì)胞幾乎全部脫落時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，收獲上清液，測(cè)定病毒含量TCID50。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝 將生長(zhǎng)成致密單層的F81細(xì)胞消化成懸液，與稀釋過(guò)的犬細(xì)小病毒YA-16-C66株同步接入3L轉(zhuǎn)瓶，每批次使用10個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶。病毒接種劑量為0.05 MOI，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 r/h。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%～90%(CPE)以上時(shí)，收獲病毒液，測(cè)定病毒含量TCID50。

1.2.4.3 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株HI效價(jià)測(cè)定將反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶獲得的犬細(xì)小病毒YA-16-C66株分別經(jīng)濃縮、β-丙內(nèi)酯滅活，加入10%比例的MONTANIDE GEL 02，依據(jù)濃縮液TCID50結(jié)果制成抗原含量為107.0TCID50/100μL、符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的犬細(xì)小病毒滅活疫苗，產(chǎn)品名稱(chēng)依據(jù)抗原生產(chǎn)批次依次命名為CPV-C1910-001、CPV-C1911-002、CPV-C1912-003。

將6～8周齡的犬細(xì)小病毒抗體陰性、健康的比格犬分為6組，每組7只。取5只按0、7日免疫程序免疫，每只1 mL/次，作免疫組；2只不免疫，作對(duì)照組。首免后28日采血，依據(jù)《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[8]進(jìn)行血清抗體效價(jià)測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 F81細(xì)胞最佳接種密度 以不同密度接種，F(xiàn)81細(xì)胞最大密度差異較小，但達(dá)到最大密度的時(shí)間不同，如圖1所示。按0.5×107/g接種時(shí)，細(xì)胞增長(zhǎng)較慢，到168 h細(xì)胞達(dá)到最大量。按2.5×107/g接種細(xì)胞比按1.5×107/g接種細(xì)胞提前一天達(dá)到最大密度，但達(dá)到最大密度后糖耗下降較快。按1.5×107/g接種時(shí)，F(xiàn)81細(xì)胞在紙片載體上生長(zhǎng)和糖耗關(guān)系如圖2所示，細(xì)胞生長(zhǎng)與糖耗呈正相關(guān)，培養(yǎng)120 h后，細(xì)胞從9.0×106增加到8.92×107，糖耗最大達(dá)到3.58 mg/mL。因此，確定F81細(xì)胞最佳接種密度為1.5×107/g。

圖1 不同接種密度葡萄糖消耗曲線(xiàn)Fig 1 Glucose consumption curve of different inoculation densities

圖2 初始接種密度為1.5×107/g時(shí)的糖耗與細(xì)胞總量關(guān)系Fig 2 The relationship between glucose consumption and cell density with the initial concentration densities was 1.5×107/g

2.2 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量不同感染復(fù)數(shù)(MOIs：0.05、0.1、0.2、0.4)接毒對(duì)生物反應(yīng)器中犬細(xì)小病毒YA-16-C66株擴(kuò)增的影響如圖3所示，按0.05 MOI與0.1 MOI接毒，病毒達(dá)最大增殖能力的時(shí)間分別為96 h和72 h，且維持時(shí)間較長(zhǎng)；高于0.1 MOI接種病毒時(shí)，細(xì)胞病變過(guò)快，細(xì)胞維持時(shí)間短，導(dǎo)致最終病毒滴度下降較快。由圖4、圖5可知，犬細(xì)小病毒YA-16-C66株病毒含量與糖耗呈正相關(guān)，四種接毒劑量的收獲液病毒含量均能達(dá)到106.0TCID50/100μL以上。綜合考慮，確定犬細(xì)小病毒YA-16-C66株接毒劑量為0.05 MOI。

圖3 按不同MOI接種病毒的糖耗曲線(xiàn)Fig 3 Glucose consumption curve of virus inoculation according to different MOI

圖4 按0.05 MOI接種病毒時(shí)的糖耗與病毒含量關(guān)系Fig 4 The relationship between glucose consumption and lgTCID50 with the virus inoculated at 0.05 MOI

圖5 按不同MOI接種時(shí)收獲液的病毒含量Fig 5 The lgTCID50 in harvest fluid inoculated with different MOI

2.3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化 兩種溫度不同時(shí)間收獲液病毒含量TCID50結(jié)果如圖6所示，1#反應(yīng)器收獲液病毒含量在72 h達(dá)到峰值，為107.7TCID50/100μL，但病毒含量下降較快，96 h降為106.8TCID50/100μL。2#反應(yīng)器收獲液病毒含量達(dá)到峰值的時(shí)間為96 h，且到120 h病毒含量仍能維持在107.4TCID50/100μL，溫度適當(dāng)降低能維持細(xì)胞較長(zhǎng)存活時(shí)間，對(duì)總病毒含量的提升更有利。綜合分析，確定犬細(xì)小病毒YA-16-C66株反應(yīng)器培養(yǎng)工藝為：采用同步接毒法，培養(yǎng)基為含1%新生牛血清的199溶液，細(xì)胞接種密度為1.5×107/g，接毒劑量為0.05 MOI，在pH 7.2條件下，37.0 ℃培養(yǎng)48 h后降溫到35.0 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，且待細(xì)胞病變達(dá)到80%～90%時(shí)收獲上清液。

圖6 不同溫度下犬細(xì)小病毒YA-16-C66株增值曲線(xiàn)Fig 6 Proliferation curve of YA-16-C66 strain of Canine Parvovirus at different temperatures

2.4 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株工藝比較 3批次反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量和總量結(jié)果如表1：接毒后反應(yīng)器中細(xì)胞能維持4～5 d，收獲液病毒含量在107.6～107.8TCID50/100μL之間，收獲液體積約為10.5 L；轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)能維持4 d，收獲液產(chǎn)量約為3 L，收獲液病毒含量在105.9～106.5TCID50/100μL之間。反應(yīng)器比轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量高1.1～1.9 lgTCID50/100μL；相同培養(yǎng)面積，反應(yīng)器所得病毒總量是轉(zhuǎn)瓶所得病毒總量的2.8～18.5倍。

表1 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量和產(chǎn)量Tab 1 The content and yield of virus in the reactor and the spinner harvester

2.5 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株HI抗體效價(jià)測(cè)定 3批次反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品HI抗體效價(jià)結(jié)果如表2：所有試驗(yàn)犬只免疫28 d的血清凝集效價(jià)均≥1∶896，能達(dá)到有效保護(hù)，同時(shí)對(duì)照組犬只的血清HI效價(jià)均顯示為1∶10，即無(wú)抗體產(chǎn)生。

表2 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品HI抗體效價(jià)Tab 2 HI antibody titer of the reactor and spinner technology products

3 分析與討論

3.1 F81細(xì)胞培養(yǎng)載體 對(duì)于貼壁細(xì)胞而言，傳統(tǒng)的小型培養(yǎng)容器有培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠、轉(zhuǎn)瓶等，利用反應(yīng)器培養(yǎng)貼壁細(xì)胞一般借助于微載體和紙片載體。相比于培養(yǎng)瓶和細(xì)胞工廠的靜置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟的特點(diǎn)，而且細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓柱狀瓶中，培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)瓶不停旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸營(yíng)養(yǎng)液并進(jìn)行空氣交換，更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。因?yàn)橹貜?fù)性好，放大只需要簡(jiǎn)單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)常用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過(guò)渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞的一種途徑。

紙片載體是順應(yīng)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)而發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)載體，相對(duì)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，利用反應(yīng)器進(jìn)行紙片載體培養(yǎng)細(xì)胞具有節(jié)省勞動(dòng)力、占地空間小，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積大，細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，培養(yǎng)時(shí)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并控制環(huán)境條件等優(yōu)點(diǎn)。紙片載體多層張力結(jié)構(gòu)能保證培養(yǎng)基與細(xì)胞充分接觸，培養(yǎng)基流過(guò)載體層，攪拌剪切力和通氣氣泡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響，更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。在5L NBS反應(yīng)器中，150 g紙片載體能提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積為2.25×105cm2，相當(dāng)于150個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶提供的表面積，根據(jù)糖耗與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，F(xiàn)81細(xì)胞在5L反應(yīng)器中生長(zhǎng)的最大量能達(dá)到3.02×1010/g，而具有同樣生長(zhǎng)面積的轉(zhuǎn)瓶中F81細(xì)胞最多能達(dá)4.90×109，相差6倍。

3.2 F81細(xì)胞培養(yǎng)犬細(xì)小病毒工藝 利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)病毒屬于勞動(dòng)密集型方法，需要眾多人員，步驟繁瑣，比較容易發(fā)生污染，而且轉(zhuǎn)瓶單位體積產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過(guò)程中環(huán)境差異及人員操作誤差常導(dǎo)致不同批次毒價(jià)不穩(wěn)定[10]。

利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)F81細(xì)胞，可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與調(diào)控溫度、pH、溶氧等參數(shù)，細(xì)胞密度和活力高于轉(zhuǎn)瓶或者固定的平面等培養(yǎng)系統(tǒng)。隨著細(xì)胞灌流技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)與病毒生產(chǎn)條件不一致的工藝，降低培養(yǎng)溫度，提高代謝所需物質(zhì)，最終能有效提高病毒的產(chǎn)量與質(zhì)量[11-12]。利用5L反應(yīng)器與3L轉(zhuǎn)瓶同時(shí)培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株，生物反應(yīng)器收獲液病毒含量均在107.0TCID50/100μL以上，而轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量從105.9TCID50/100μL到106.5TCID50/100μL；相同培養(yǎng)面積，反應(yīng)器所得病毒總量是轉(zhuǎn)瓶所得病毒總量的2.8～18.5倍；相同抗原含量的滅活苗，反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品無(wú)顯著性差異，血凝抑制效價(jià)均為1∶896。

4 結(jié) 語(yǔ)

本試驗(yàn)確定了NBS生物反應(yīng)器培養(yǎng)F81細(xì)胞生產(chǎn)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株的工藝，屬于該毒株在NBS生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的初步探索。利用該工藝培養(yǎng)的犬細(xì)小病毒YA-16-C66株，抗原滴度達(dá)到107.8TCID50/100μL，工藝產(chǎn)品血凝抑制效價(jià)HI在1∶768以上，完全達(dá)到犬細(xì)小滅活苗制備的要求[13]，且比轉(zhuǎn)瓶工藝抗原產(chǎn)量高，極大的節(jié)約了生產(chǎn)成本，為犬細(xì)小病毒YA-16-C66株的產(chǎn)業(yè)化提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。