王秀麗，于 永，于 雷，辛凌翔，張 媛，李俊平，李旭妮*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095; 3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100095)

傳染性鼻炎(Infectious Coryza, IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)引起的一種雞的急性上呼吸道疾病，以流鼻涕、打噴嚏、眶下竇腫脹以及臉部水腫為特征，在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1]。20世紀(jì)80年代起，我國(guó)開(kāi)始發(fā)現(xiàn)本病的流行，馮文達(dá)[2]于1987年首次在北京分離出一株致病菌，經(jīng)血清型鑒定為 A型副雞禽桿菌。林毅等[3]于1995年在發(fā)病蛋雞場(chǎng)分離到A和C血清型。張惠玲、苗得園等[4-5]于2003年和2005年分離出B血清型副雞禽桿菌。近幾年雞傳染性鼻炎在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[6]。2018～2019年，安徽省多家白羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)持續(xù)出現(xiàn)疑似傳染性鼻炎的爆發(fā)和流行，為了解雞群疫病流行狀況，制定更科學(xué)的防控策略，本研究從不同批次發(fā)病雞的眶下竇中分離致病菌，并對(duì)其進(jìn)行了全面鑒定。

1 材料及方法

1.1 病料來(lái)源 22份病料，于2018年8月～2019年9月從安徽省多家大型白羽肉雞養(yǎng)殖公司疑似雞傳染性鼻炎發(fā)病雞群中采集，發(fā)病雞主要表現(xiàn)為面部單側(cè)或兩側(cè)腫脹、打噴嚏，流鼻涕等。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 TSA、TSB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，雞血清、NAD、生化鑒定管購(gòu)自Fermentas公司；DNA maker、2×Taq PCR Mster Mix購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。抗原0083(A)、0022(B)、Modesto(C),A、B、C陽(yáng)性對(duì)照血清由天津瑞普生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 35～40 d SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 副雞禽桿菌的分離 將病雞頭置于超凈臺(tái)內(nèi)，用燒紅的刀片消毒眶下竇外表面，無(wú)菌切開(kāi)眶下竇，用接種環(huán)取眶下竇分泌物，劃線接種含 10% 雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂平板，將平板倒置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)特性。挑取圓形、露滴狀、透明凸起帶藍(lán)色熒光的可疑菌落，接種含10%雞血清和0.01% NAD 的TSA瓊脂平板。于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～20 h，若平板上的細(xì)菌純粹生長(zhǎng)，挑取菌落分別接種含10%雞血清和0.01% NAD 的TSA瓊脂平板和含10%雞血清不含NAD的TSA瓊脂平板，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～20 h后，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.5 回雞試驗(yàn) 挑取在10%雞血清和0.01% NAD的TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在不含NAD的TSA平板上不生長(zhǎng)的單菌落，接種含10%雞血清和0.01%NAD的TSB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，取新鮮培養(yǎng)物0.2 mL，分別眶下竇接種8只35～40 d SPF雞，另4只注射等量含10%雞血清和0.01% NAD的TSB作對(duì)照。接種后24～48 h觀察其臨床表現(xiàn)，發(fā)病雞按1.4項(xiàng)進(jìn)行病原分離。取僅在10%雞血清和0.01% NAD的TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的分離株進(jìn)一步鑒定。

1.6 形態(tài)及生化特性 從含10%雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂平板上，取單菌落接種含10%雞血清和0.01% NAD的TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，取適量新鮮菌液進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)；取適量細(xì)菌懸液接種微量細(xì)菌生化鑒定管(NAD終濃度0.01%)，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察細(xì)菌的生化特性。

1.7 16 s rRNA序列分析 用細(xì)菌16S rRNA的通用引物27F和1492R擴(kuò)增分離菌的16S rRNA序列。上游引物序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。反應(yīng)程序： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min (30個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增的結(jié)果。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，與GenBank中公布的序列比對(duì)。

1.8 血清型鑒定 參照雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T538-20157[7]，用分離菌株制備血凝抗原，測(cè)定抗原的凝集效價(jià)，配制4單位抗原，與A、B、C型的分型血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，測(cè)定血凝抑制效價(jià)，判定分離株的血清型。根據(jù)Ryuichi Sakamoto等[8]創(chuàng)建的多重PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。結(jié)合血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，判定分離菌株的血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離 從可疑病雞中共分離出8株細(xì)菌，此8株菌均在含10%雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂平板上形成直徑0.3 mm左右，圓形、光滑、灰白色、半透明露滴樣、邊緣整齊的小菌落(圖1)，在低倍顯微鏡下45°折光觀察有較強(qiáng)的熒光。在不含NAD的TSA瓊脂平板上不生長(zhǎng)。

2.2 回雞試驗(yàn) 8株分離菌株接種35～40 d SPF雞24 h后，試驗(yàn)雞均出現(xiàn)食欲減少，面部和眼瞼部水腫、流淚，流涕等臨床癥狀，且均從發(fā)病雞眶下竇中分離到副雞禽桿菌。對(duì)照組無(wú)任何臨床癥狀。

2.3 形態(tài)、培養(yǎng)特性及生化特性 從回雞試驗(yàn)發(fā)病雞眶下竇分離的細(xì)菌均在含10%雞血清和0.01%NAD的TSA瓊脂平板上形成直徑0.3 mm左右，圓形、光滑、灰白色、半透明露滴樣、邊緣整齊的小菌落(圖1)，且在低倍顯微鏡下45°折光觀察有較強(qiáng)的熒光；取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性短桿菌或球桿菌，單個(gè)或短鏈排列(圖2)；分離的8株菌生化鑒定結(jié)果一致(表1)，符合副雞禽桿菌的生化特性。

圖1 分離株在含10%雞血清和0.01%NAD的TSA瓊脂平板上的菌落形態(tài)Fig 1 Characteristics of isolated bacteria on TSA plates with 0.01% NAD and 10% chicken serum

圖2 副雞禽桿菌革蘭氏染色圖Fig 2 Gram stain of Avibacterium paragallinarum

表1 分離株的生化特性Tab 1 Characteristic of isolated strains

2.4 16S rRNA 序列分析 8株分離株均擴(kuò)增出約1.5 kb的條帶(圖3)，序列與GenBank中的序列比對(duì)結(jié)果顯示，8株分離菌均為副雞禽桿菌。

M：DNA maker DL 2000 bp;1～8：AH-1到AH-8分離株;N：陰性對(duì)照;P：陽(yáng)性對(duì)照M：DNA maker DL 2000 bp;1～8： AH-1～AH-8 strains isolated;N: negative;P: positive圖3 8株分離菌16S rRNA基因PCR結(jié)果Fig 3 16S rRNA PCR results for 8 strains isolated

2.5 血清型鑒定 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，8株分離菌AH-1為A型副雞禽桿菌，AH-2～AH-8為B型副雞禽桿菌(表2)；PCR鑒定結(jié)果顯示，AH-1株擴(kuò)增出約0.8 kb的條帶，為A型副雞禽桿菌AH-2到AH-8株均擴(kuò)增出約1.1 kb的條帶，為B型副雞禽桿菌(圖4)。血清學(xué)鑒定和PCR鑒定結(jié)果一致。

表2 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Test results for HI

M：DNA maker DL 2000 bp;1～8：AH-1到AH-8分離株M：DNA maker DL 2000 bp;1～8：AH-1 to AH-8 strains isolated圖4 分離株多重PCR結(jié)果Fig 4 Multi-PCR results for isolated strains

3 討論與結(jié)論

副雞禽桿菌的血清型非常復(fù)雜，目前常用的有Page分型法，將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個(gè)血清型[9]，日本科研人員開(kāi)發(fā)的一系列單克隆抗體將副雞禽桿菌劃分為Page血清型，但該方法單克隆抗體供應(yīng)有限，只有很少實(shí)驗(yàn)室可以操作，有的沒(méi)有血清型特異性，未被廣泛應(yīng)用[10]。Kume等提出了一種血清學(xué)分類方法，目前認(rèn)識(shí)的Kume血清型有9個(gè)，分別為A1、A2、A3、A4、B1、C1、C2、C3，C4[11]。由于分類技術(shù)要求很高，Kume方案也未得到廣泛認(rèn)可，本研究按照雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T538-20157的方法和PCR方法進(jìn)行血清分型，結(jié)果一致。

2017年，龔玉梅等對(duì)我國(guó)雞傳染性鼻炎流行態(tài)勢(shì)分析顯示，我國(guó)近幾年雞傳染性鼻炎以B型株為主[6]。本實(shí)驗(yàn)室從2018～2019年對(duì)安徽省若干大型白羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)疑似感染雞傳染性鼻炎的病雞體內(nèi)分離到副雞禽桿菌，以B型為主，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道雞傳染性鼻炎造成的最大經(jīng)濟(jì)損失是育成雞生長(zhǎng)不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降[12]。本實(shí)驗(yàn)室近兩年分離的副雞禽桿菌均是從24～30 d 的肉雞中分離，感染雞趨于低齡化；所有分離株均能復(fù)制出典型的雞傳染性鼻炎病例，說(shuō)明流行毒株毒力較強(qiáng)；8次分離鑒定中7次為B型菌株流行，說(shuō)明安徽地區(qū)B型菌株是重要的流行毒株；進(jìn)行細(xì)菌分離的所有廠區(qū)均免疫了雞傳染性鼻炎的三價(jià)滅活疫苗，免疫失敗說(shuō)明該地區(qū)的流行毒株與疫苗株間交叉保護(hù)效果不理想。本次細(xì)菌分離及流行病學(xué)調(diào)查對(duì)于當(dāng)?shù)氐囊卟》揽鼐哂兄匾笇?dǎo)意義。

目前，我國(guó)應(yīng)用的含有B型毒株的疫苗只有三種。免疫了傳染性鼻炎A型、B型、C型三價(jià)滅活疫苗的雞群，仍會(huì)持續(xù)爆發(fā)雞傳染性鼻炎。免疫失敗表明副雞禽桿菌同種血清型不同株之間的交叉保護(hù)效果不理想。有文獻(xiàn)報(bào)道，NAD非依賴型的副雞禽桿菌也在我國(guó)部分區(qū)域分離到，且NAD依賴型傳染性鼻炎的疫苗對(duì)NAD非依賴型副雞禽桿菌的保護(hù)性很低[13]。分離、篩選出抗原性好、免疫譜廣的菌株對(duì)研制疫苗和防控疾病具有重要意義。上述分離毒株的毒力、免疫原性均有待進(jìn)一步研究。